바이러스 플라크 분석을 위한 액상 오버레이 시스템의 평가

출처: Baer, A. 및 Kehn-Hall, K. 플라크 분석을 통한 바이러스 농도 결정: 전통적 및 새로운 오버레이 시스템의 사용. J. Vis. Exp. (2014).

이 영상에서는 전통적인 반고체 아가로스 오버레이와 비교하여 바이러스 플라크 형성 효율을 분석함으로써, 플라크 기반 분석법에서 액상 미세결정성 셀룰로오스 기반 오버레이의 사용법을 보여줍니다.

1. 세포 및 시약 준비

분석 전날, 해당 바이러스에 적합한 호스트 세포를 플레이트에 도말합니다(표 1 및 표 2) 90 - 100% 합류도(confluency)에서.
$\text{H}_2\text{O}$에 10% 포름알데히드를 포함하는 고정액을 준비합니다.₂O. 예를 들어, 36% 포름알데히드 스톡액 5.56 ml와 증류수 14.44 ml를 혼합합니다.₂O (dH2O)₂O).
참고: 포름알데히드를 사용할 때는 적절한 안전 취급 수칙을 준수하고 환기 장치를 사용하십시오.
크리스탈 바이올렛 염색액 준비: 20% 에탄올 및 증류수(dH2O)에 크리스탈 바이올렛(CV) 1% 농도로 조제₂O.
2배 농도의 플라크 배지를 준비합니다(세포 유형에 따라 2배 농도로 준비; 참조: 표 2). 다음을 사용하여 여과하십시오. 0.2 µm 시약 중 멸균되지 않은 것이 있다면 여과하십시오.
고정 오버레이의 준비 (표 3)
1. 액체 오버레이를 위해, dH2O에 Avicel 2.4% 멸균 용액을 제조하십시오.₂O. 뭉침을 방지하기 위해, 스터 바(stir bar)로 빠르게 혼합 중인 물이 담긴 플라스크에 분말을 첨가하십시오. Avicel을 천천히 붓고 실온(RT)에서 빠르게 교반하십시오. 용액의 점도가 너무 높아져 스터 바로 균질화하기 어려울 경우, 플라스크 쉐이커(flask shaker)로 전환하여 >균일한 균질화를 위해 강하게 교반하며 30분 동안 유지합니다.
  참고: 스톡 용액을 더 낮은 농도로 제조할 수 있으나, 이 경우 용액이 분리될 수 있으므로 균질화를 위해 다시 혼합해야 합니다. Avicel의 작동 용액은 0.6-3% 범위 내에서 사용할 수 있습니다.
2. 균질화 후, 용액을 오토클레이브로 멸균하고 밀봉하여 상온(RT)에서 보관하십시오.
3. 아가로스 및 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) 오버레이를 위해, 증류수(dH2O)로 스톡 용액을 준비하십시오.₂2% CMC 또는 0.6% agarose를 혼합합니다. 마그네틱 바(stir bar)를 사용하여 섞은 후, 오토클레이브(autoclave) 또는 전자레인지를 사용하여 완전히 용해시킵니다.

2. 희석 및 감염

플레이팅 다음 날, 분석을 시작하기 전에 세포의 합일도(confluency)와 생존력을 육안으로 확인하십시오. 표준적인 세포 형태를 유지하고 약 90% 합일도의 단층이 형성되었는지 확인하십시오.
감염 샘플을 10배 단계 희석하십시오. 바이러스 증식에 사용한 세포 성장 배지를 희석액으로 사용하십시오(표 2). 해당 바이러스의 예상 역가에 따라 필요한 희석 횟수를 조절하며, 세포 생존력을 독립적으로 확인하고 플라크 식별을 돕기 위해 항상 비감염 대조군 샘플을 사용하십시오.
단계 희석액을 사용하여 세포를 45분에서 1시간 동안 감염시키십시오(표 1). 세포를 덮을 수 있는 충분한 양의 접종액을 사용하되, 바이러스와 단층의 접촉을 최대화하기 위해 부피를 가능한 한 낮게 유지하십시오(표 4). 균일한 도포를 보장하고 세포 단층이 마르는 것을 방지하기 위해 20분마다 플레이트를 부드럽게 흔들어 주십시오.
감염 후, 2x 플라크 배지와 선택한 고정 오버레이(CMC, agarose 또는 Avicel)를 1:1로 혼합하여 적절한 부피의 고정 배지를 웰 내의 접종액 위에 직접 오버레이하십시오(표 2). 부드럽게 흔들어 혼합하십시오.
1. 액체 오버레이의 경우, 가온된 2x 플라크 배지와 1.2-2.4% RT stock Avicel을 1:1로 혼합하여 0.6-1.2% Avicel 오버레이 배지 작동액을 조제하십시오.
2. 아가로스 오버레이의 경우, 가온된 2x 플라크 배지와 가열된 0.6% 아가로스 스톡 용액을 1:1로 혼합하여 56 °C 항온수조에서 30분 동안 방치하여 온도를 맞춤으로써 최종 아가로스/오버레이 농도를 0.3%로 만드십시오.
3. CMC의 경우, 2% 스톡 용액을 준비하여 아가로스 오버레이와 동일한 방법으로 처리하십시오.
4. 단층에 오버레이를 적용할 때, 단층의 손상을 방지하기 위해 항상 가열된 아가로스나 CMC를 56 °C 물에서 평형화하십시오. 세포 사멸과 바이러스 역가 감소를 방지하기 위해 용액이 따뜻하되 만졌을 때 뜨겁지 않은지 확인하십시오. 대부분의 아가로스 오버레이는 42 °C 미만에서 응고되기 시작하므로, 취급 중 응고를 방지하기 위해 신속하게 작업하거나 소량씩 준비하십시오.
오버레이 추가 후, 명확하게 계수 가능한 뚜렷한 플라크가 형성되도록 플레이트를 배양하십시오. 플라크 형성에는 분석하는 바이러스에 따라 2~14일이 소요될 수 있습니다(표 1}.
참고: 액체 오버레이 플레이트를 배양기에 넣은 후에는 움직이지 마십시오. 배양 기간 동안 액체 오버레이가 움직이면 플라크가 번질 수 있습니다. 아가로스와 CMC 오버레이는 반고체 상태이므로, 플라크 발달 상태를 모니터링하기 위해 주기적으로 이동시키거나 광학 현미경으로 확인해도 됩니다.

3. 세포 고정 및 염색

세포를 고정하려면 Avicel 오버레이를 따라내거나 흡입하여 제거하고, 10% 포름알데히드 용액을 사용하여 30분에서 하룻밤 동안 세포를 고정합니다(6웰 플레이트의 경우 웰당 <1 ml).
1. 아가로스 또는 CMC의 경우, 포름알데히드 용액을 오버레이에 직접 첨가하여 1시간에서 하룻밤 동안 처리합니다.
  주의: 고정액이 증발하여 마르지 않는다면 샘플을 장기간 보관할 수 있으며, 고정액이 마를 경우 단일층이 왜곡될 수 있습니다.
염색 전 고정 단계가 끝나면 포름알데히드를 버리고, 아가로스와 CMC의 반고체 플러그를 흐르는 물로 또는 스패튤라를 사용하여 수동으로 제거합니다. Avicel 플라크는 염색 전 잔류 오버레이/고정액을 제거하기 위해 물로 헹굽니다.
염색을 위해 최소량의 크리스탈 바이올렛 용액으로 세포를 약 15분간 덮어줍니다. 필요 시 플레이트를 흔들어 골고루 덮이도록 합니다.
크리스탈 바이올렛 염색약을 물로 부드럽게 씻어냅니다. 고정, 염색 및 건조가 완료되면 플라크를 향후 분석을 위해 무기한 보관합니다.

표 1. 플라크 분석 접종 조건 및 세포 유형

	RVFV	VEEV	Influenza B
세포 유형	Vero	Vero	MDCK
감염 기간	1 hr	1 hr	45 min
배양 시간	3 days	2 days	3 days

표 2. 플라크 및 바이러스/세포 성장 배지

	RVFV	VEEV	Influenza B
세포 종류	Vero	Vero	MDCK
배양 유형	DMEM¹	DMEM¹	DMEM²
플라크 배지	2xEMEM^A	2xEMEM^A	2xEMEM^B

1. 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum), 1% L-Glutamine, 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium.

2. 1% L-Glutamine, 1% Penicillin/Streptomycin, 0.2% Bovine Serum Albumin, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran 50ug/ml이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium.

A. 5% FBS (25 ml), 1% 최소 필수 아미노산 (5 ml), 1% Sodium Pyruvate (5 ml), 1% L-Glutamine (5 ml), 2% Pen/Strep (10 ml)가 첨가된 2x 최소 필수 배지 (500 ml).

B. 0.2% 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin), 1% 필수 아미노산(Minimum Essential Amino Acids, 5 ml), 50ug/ml, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK*가 첨가된 2x 최소 필수 배지(Minimal Essential Media, 500 ml)

*준비 직전에, 플라크 형성을 위해 아가로스와 혼합하여 사용할 분주액에 2 µg/ml TPCK-Trypsin 스톡 용액을 25 ml당 1 µl씩 첨가하십시오.

표 3. 오버레이 스톡

	RVFV	VEEV	Influenza B
세포 종류	Vero	Vero	MDCK
감염 기간	1 hr	1 hr	45 min
배양 시간	3 days	2 days	3 days

표 4. 플레이트 형식

	6 웰	12 웰	96 웰
웰당 세포 수	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
접종액 부피 (μl)	400	200	50
오버레이 부피 (ml)	3	1.5	0.100

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
크리스탈 바이올렛	Sigma Aldrich	C3886-25G
포름알데히드 용액	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	재구성 시 다음 시간 동안 격렬하게 흔들어 섞어 주십시오. >균질화하는 데 30분 소요
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-100
카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨염, 중간 점도	Sigma Aldrich	C4888

바이러스 플라크 분석을 위한 액상 오버레이 시스템의 평가

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