칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

요약

칼슘은 시냅스 강도 신경 전달 물질 릴리스 및 변경 실행을위한 필수적인 신경 시스템에 유비 쿼터스 메신저입니다. 여기 ⁺ - 지표 Drosophila 신경 터미널에 ^{칼슘이 로딩을위한} 기술을 보여줍니다. 우리는 또한 필요한 장치의 제조를 설명하고 기술의 성공을위한 중요한 포인트를 강조.

초록

칼슘은 신경 계통에 많은 역할을 담당하고 있지만 신경 전달 물질 릴리스에 대한 트리거로보다 인상하고, 학습 및 메모리를 지원하는 시냅스 소성에 필수적인 메신저로서보다 그리하여 더 깊이 없음. 추가로 칼슘 ^2의 분자 토대를 명료하게하다하려면 ⁺ 종속적인 시냅스 메커니즘, 모델 시스템은 유전자 가단과 생리학에 액세스할 모두되어 있어야합니다. Drosophila melanogaster 같은 모델을 제공합니다. 이 시스템에서 유전자 인코딩 형광 표시기 신경 터미널에서 칼슘 ^{2 +} 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나 이러한 지표 칼슘 ² 민감성을 제한 ⁺ 종종 비선형 응답을 보여줍니다. 합성 형광 표시기가 더 빠른 칼슘 ^{2 +} 신경 활동과 관련된 변화를 측정에 적합합니다. 여기 Drosophila의 유충에 살고 신경 터미널에 dextran - 복합 합성 칼슘 ^{2 +} 지표를로드하는 방법을 보여줍니다. 특정 강조 그러한 연장 로딩 기간 동안 준비의 건강을 유지, 절연 신경을 따라 정전기의 방전을 방지하는 방법으로 기술의 성공에 가장 중요한 프로토콜의 이러한 측면에 배치하고, 칼슘 ² 제공하여 축삭의 생존을 보장합니다 ⁺ 절단 축삭의 엔딩의 씰링 추진. 낮은 친화력은 dextran - 복합 등 fluo - 4 및로드 '로 ⁺ - 지표, 칼슘 ^{2 +} 최소한 역학 presynaptic 칼슘 ² 방해하면서 높은 신호 대 잡음 비율을 보여주 어떤 사용할 수 있습니다. Dextran - 활용은 ⁺ 표시가 같은 mitochondria로 organelles로 압수되는 칼슘 ² 방지할 수 있습니다. 로딩 기법은 애벌레, 배아와 성인을 동등하게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 어떤 fixatives에 노출되지 않은 깨끗한 절개 요리를 선택합니다.
   
   
2. 칼슘 ² 포함 슈나이더의 Drosophila 매체에서 방황 제 ³ instar Drosophila의 유충을 해부하다 ^+와 L - 글루타민 (모든 신경 손상이나 근육 섬유 Nos. 7, 6, 13 또는 12 깎지 않아.)
   
   
3. 12 마이크론 팁 (내경)과 유리 필링 - 피펫을 선택합니다.
   
   
4. 주사기와 튜브를 사용하면 (피펫에 부정적인 압력을 적용) 피펫 팁을 방해하지 않도록하십시오.
   
   
5. 유리 피펫의 길이를 삽입할 수 고급 플라스틱 충전 - 필라멘트를 선택합니다.
   
   
6. ⁺ - 표시기 플라스틱 필라멘트에 5 밀리미터 dextran - 복합 칼슘 ² ~ 1cm을 그립니다.
   
   
7. 모든 세그먼트 신경 컷.
   
   
8. 피펫 팁의 해부 유충의 복부 정중선 접근 수있는 램프에 피펫을 지원한다.
   
   
9. 피펫의 끝 (슈나이더의 중간의 작은 금액을 포함)으로, 신경을 곤란하게하지 않고, 제 4 세그먼트에 신경의 절단 끝을 그립니다.
   
   
10. 필라멘트의 끝부분이 (신경을 만지지 않도록) 신경의 절단 끝 50 미크론 이내 때까지 튜브를 제거하고 피펫으로 플라스틱 필라멘트를 삽입합니다.
    
    
11. 꺼내기 충분한 ^칼슘이 33 % (최종 농도가 <2mM한다)의 슈나이더의 매체의 볼륨을 증가 종료 신경에 ⁺ - 표시. 중요 - 이것은 신경을 절단 5 분 이내에 완료해야합니다.
    
    
12. 상온에서 어둠의 준​​비를 놓고 신경 부하 동안.
    
    
13. 40 분 필라멘트를 사용하여 칼슘 ^{2 +} - 표시기를 제거한 후.
    
    
14. 장소에 피펫을두고 이것은 신경에 자극 펄스를 적용하는 데 사용됩니다로서, 신선한 슈나이더의 매체로 완전히 채우십시오.
    
    
15. 칼슘 ^{2 +} - 표시등이 최소 60 분 동안 신경 평형 수 있지만 더 이상 4보다 시간, CA ^{2 +} 영상을 시작하기 전에.
    
    
16. 신선한 슈나이더의 중간 30 분 간격으로 그것이 equilibrating하는 동안과 준비를 씻어.
    
    
17. 이미징 전에 20 분 Hemolymph - 마찬가지로 6 번 솔루션 (; 맥레오드 ​​외​​ 2002;. 2003 HL6)와 슈나이더의 매체를 대체합니다.
    
    
18. L - glutamic 산성 또는 글루 탐 산염은 신경 evoked 근육 수축 방지하기 위해 postsynaptic 글루 탐 산염 수용체를 감도를 줄이다하는 7mM에서 HL6 솔루션에 추가할 수 있습니다 (맥레오드 ​​외​​를 2004;. 레이프 외가 2002;. 2005).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Schneider’s Insect Medium	시약	Sigma-Aldrich	S0146	L-glutamine 및 칼슘이 포함되어야 함
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	시약	Sigma-Aldrich	G1626