과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에 초점을 맞출 것이다.
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이 논문에서
요약
초록
개발 Drosophila melanogaster의 배아는 공촛점 이미징 살고 매우 의무가 아르 셀 모양 변경 번호를 겪습. 파리에서 셀 모양 변경은 더 높은 유기체에있는 사람들에게 유사하며, 그들은 조직 morphogenesis 운전. 그래서, 많은 경우에 그들의 연구는 인간의 질병 (표 1) 1-5 이해에 대한 직접적인 의미가 있습니다. 하위 세포 규모에서 이러한 세포 형태의 변화는 유전자 발현의 신호 전달, 세포 극성, cytoskeletal 개조 및 멤브레인 인신 매매에 이르기까지 활동의 제품입니다. 따라서 Drosophila의 배아들은 조직 morphogenesis 관련된으로 세포 모양의 변화를 평가할 수있는 상황뿐만 아니라를 제공뿐만 아니라 모양 세포 그 하위 세포 활동을 연구하기 위해 완전히 생리 환경을 제공합니다.
프로토콜 이미지 cellularization라는 특정 세포 모양의 변화를 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. Cellularization는 극적인 플라즈마 막 성장의 과정이며, 그것은 궁극적으로 세포 배반엽에 syncytial 배아를 변환합니다. mitotic주기 14 계면에서 즉, 플라즈마 막 동시에 기본 상피 세포의 시트를 생성하기 위해 ~ 6000 cortically 고정 핵의 각 주위 invaginates. 이전 제안을 카운터, cellularization는 마이 오신 - 2 수축성 6 주도 아니지만, 대신에 주로 내부 매장 7 막의 exocytosis에 의해 연료입니다. 따라서 cellularization는 cytokinesis 또는 가로 - 가느다란 관 (T - 가느다란 관) 근육의 morphogenesis로 플라즈마 막 invagination 또는 확장을 필요로 세포 모양의 변화 동안 멤브레인 인신 매매를 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다.
이 프로토콜은 쉽게 파리 배아의 다른 세포 형태 변경의 이미지에 적용하고, 그러한 배아 컬렉션의 무대를 변경하거나, 특정 방향 (테이블에있는 배아를 탑재 "배아 접착제"를 사용하는 것과 약간의 adaptations을 필요로됩니다 1) 8-19. 모든 경우에 흐름은 기본적으로 (그림 1)과 동일합니다. 복제 및 Drosophila transgenesis에 대한 표준 방법은 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 그 변종에 융합, 관심의 단백질을 표현 안정적인 비행 주식을 준비하는 데,이 파리들은 배아의 재생 소스를 제공하고 있습니다. 또는 형광 단백질 / 프로브 직접 간단 마이크로 사출 기술을 통해 90-10 플라이 배아에 도입하고 있습니다. 그런 다음, 발달 행사 및 몇 군데으로 세포 모양의 변화에 따라 태아가 수집되고 해부 현미경의 형태로 개최하고, 마지막으로 위치 및 공촛점 현미경에서 시간 저속 영상에 대한 마운트.
프로토콜
1. 엠브료 컬렉션 컵 조립
- 가능한 한 매끄러운로 가장자리를 만들고 레이저로 100 ML 트라이 - 옥수수 비커의 바닥을 잘라. 이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 컵, 당신은 또한 상단에서 세 모서리를 장식하는 경우 처리하기가 쉽습니다.
- 와이어 메쉬 (6cm X 6cm)의 정사각형을 잘라. 미리 예열 뜨거운 접시에, 내부 퓸 후드, 레이어 강력 알루미늄 호일의 조각 위에 와이어 메쉬의 광장. 단단히 뜨거운 메쉬에 컵 컷 아래쪽 가장자리에 밀어. 몇 초 동안 잠깐 만요, 지금 첨부 메쉬와 컵 리프트. 호일도 경우엔 그냥 풀어 껍질.
- 하룻밤 잔 쿨. 미세 입자 사포와의 날카로운 가장자리에서 초과 가위로 메쉬와 모래를 제거합니다.
2. 애플 쥬스 아가르 번호판 확인
- 6L 플라스크에 100g BD Bacto 아가르 및 3L 증류수를 결합. 느린 배기 설정 30 분 한천을 압력솥.
- 저어 바있는 2L 플라스크에 100g의 자당, 1L 사과 주스, 그리고 6g P - Hydroxybenzoic 산성이 결합되어 있습니다. 뜨거운 접시에 감동하면서 끓는 수있는 솔루션을 열. 2 개 이상 분 동안 끓여하지 마십시오. 사과 주스의 혼합물은 냉각 후 한천....
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토론
프로토콜은 여기에 개발 비행의 배아에서 세포 모양의 변화 다수의 라이브, 공촛점 이미징을 허용합니다 설명했다. 이미지에 대한 GFP 주식은 개별 연구소 (표 2)에 의해 준비하지만, 많은 이러한 주식은 인디애나 대학 (블루밍턴에서 같은 Drosophila 증권 센터로 센터에서 공개적으로 사용할 수있는 수 http://flystocks.bio.indiana.edu )과 파리통 예일 대학 (앳 증권 센터 http://flytrap.med.yale.edu ). 일단 획득이 라이브 영상 데이터는 철저하게 해당 드라이브 세포 모양의 변화와 조직 morphogenesis 단백질 기능, 하위 세포 활동, biophysical 매개 변수를 정의하는 정량 분석와 결합 수 있습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 기꺼이이 프로토콜을 개발한있는 기초를 제공 에릭 Wieschaus을 인정합니다. 우리 작품은 베르나 & 마스 맥린 생화학 계열 분자 생물학 시작 - 업 상, 의학 베일러 대학에서 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 슬라이드 글라스 | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| 커버 글라스 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| 세척병 (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml Falcon 튜브 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 소형 피펫용 벌브, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| 캡 포함 신틸레이션 바이알 | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Corn 비커, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| BD Falcon 페트리 접시 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falcon 셀 스트레이너 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 노란색 피펫 팁 | Rainin | L200 | |
| 스테인리스강 메쉬, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| 유리제 5¾ 인치 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 거름종이 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| 고무줄 | Office Max | A620645 | |
| Scotch 양면 테이프, ½ 인치 | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression 페인트 브러시 E85 라운드 #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Dumont #5 핀셋 High Precision Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| 면도날 | VWR international | 55411-050 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star 활성 건조 효모 | LeSaffre | 15700 | |
| 종이 타월, C-fold | Kleenex | ||
| 고강도 알루미늄 호일 | Reynolds Wrap | ||
| 표백제 | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% 사과 주스 | Ocean Spray 또는 Tree Top |
참고문헌
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
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