틈새와 줄기 세포를 개발하는 동안 양식 얼마나 실용적인 의미가있는 중요한 질문이다. 에 Drosophila 난소 배아 라인 줄기 세포 및 체세포의 틈새는 애벌레 개발하는 동안 형식입니다. 이 동영상은 늦은 세번째 instar (LL3)에서 여성 생식선을, 해부하다 얼룩 및 마운트하는 방법을 보여줍니다 Drosophila 애벌레.
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이 논문에서
요약
초록
많은 기관 embryogenesis 동안에 성인 생활 동안 유지 보수 또는 수리를 위해 자신의 개발을위한 줄기 세포에 따라 달라집니다. 그들이 환경과 상호 작용하는 방법에 줄기 세포 형태, 방법을 이해하는 것은 개발, 항상성 및 질병을 이해 그러므로 매우 중요합니다. 과일 파리 Drosophila melanogaster의 난소는 체세포 지원 전지 (틈새) 1, 2와 세균 라인 줄기 세포 (GSCs)의 상호 작용에 대한 영향력 모델로 재직하고 있습니다. 유전자를 조작하는 능력을 결합 틈새와 GSCs의 알려진 위치, 줄기 세포와 그 틈새 3-12 사이의 상호 작용의 다양한 명료하게하다하는 연구자를 허용하고 있습니다.
GSC 유지 및 분화를 조절하는 메커니즘에 대한 정보의 풍부한에도 불구하고, 상대적으로 조금은 GSCs 및 체세포의 틈새 시장 개발 중에 양식 방법에 대한 알려져있다. 그의 세포 컴포넌트 단자 필라멘트와 캡 세포 (그림 1), 세 번째 애벌레 instar 13-17 동안 양식을 포함 약 18 체세포의 틈새. GSCs는 원시 배아 세포 (PGCs)에서 발생한. PGCs 일찍 애벌레 단계에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지만 틈새의 형성 다음 PGCs의 하급 집단은 GSCs 7, 16, 18, 19이됩니다. 함께, 체세포의 틈새 세포와 GSCs은 유기체의 일생 동안 계란을 생산하는 기능 단위를합니다.
GSC 단위의 형성에 관한 많은 질문도 답이 남아 있습니다. 이러한 전구체 틈새와 줄기 세포 엽 성의 전구 물질에 대한 세포, 또는 그들이 GSCs가로의가 PGCs 내에서 비대칭 세대 간의 조정하는 프로세스는 최고의 유충에서 공부하실 수 있습니다. 그러나 애벌레 난소 개발 방식 연구 물리적으로 도전합니다. 첫째, 애벌레 난소 작은 수 있습니다. 비록 늦은 애벌레 단계에서 그들은 전반에만 100μm 수 있습니다. 또한, 난소 투명하고 하얀 지방이 신체에 박혀있다. 여기 형광 항체와 얼룩 다음 늦은 세번째 instar (LL3) Drosophila의 유충에서 난소를 분리를위한 단계별 절차를 설명합니다. 우리는, 난소의 위치를 침몰하지 티슈 얼룩 및 세척하고, 항체가 조직에 침투되었는지 확인하는 등의 문제 몇 가지 기술적인 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜은 이전의 애벌레 단계와뿐만 아니라 애벌레 testes에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 부설 에그
- 해부 - 5 일 : 성관계 여성은 효모와 보충 신선한 음식 2~4시간에 대한 알을 낳을 수 있습니다. 에 동기와 잘 개발 애벌레를, 그것이 중요하다 콩나물도하지 양식 (약 30 알 / 25mm 유리병). 일반적으로 7-16 여자들은 누워 얼마나 잘 따라 유리병마다 사용됩니다.
2. 애벌레 선택
- 링어의 중간 (128mM NaCl, 2mM Kcl, 1.8mM CaCl 2, MgCl 4mm짜리 2, 35.5mM 자당, 5mM Hepes의 산도 6.9)로 가득한 9 잘 유리 해부 접시를 준비합니다.
- 링어의 중간 얼음에 장소를 포함하는 여섯 잘 플레이트의 세포 strainers를 준비합니다. 또한, 우리는 나일론 메쉬가 장착되어 특별히 만든 금형을 사용합니다.
- 고급 생물 학적 핀셋 (포셉)를 사용하여 유리 벽면에서 시간이 초과되었습니다 애벌레를 선택하고 링거스 포함 해부 접시에 놓으십시오.
- 깨끗한 잘하는 여성 유충을 전송합니다. 우리가 그들의 생식선으로 남성에서 여성을 구분합니다. 남성 testes 쉽게 지방 신체의 뒷부분 세번째에 포함된 빅 클리어 타원으로 식별됩니다. 지방 신체의 같은 부....
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토론
이 비디오는 후반 세번째 instar 애벌레의 난소의 격리 및 얼룩 프로토콜을 보여줍니다. 일상적으로 안정이 프로토콜을 수행하려면, 관심은 다음 사항에 지불되어야합니다
- 동기화 및 잘 발달 애벌레의 경우, 이상의 크롤 링은 피해야합니다.
- 작은 반투명 난소의 손실을 피하기 위해 지방 몸이 그대로 해부하다에 있는지 확인하십시오. 이것은 (두 번째 혹은 세 instar의 시작) 이하 난소를 장착 특히, 장착 단계에서 난소를 찾는데 도움이 될 것입니다.
- 한 번에 많은 샘플을 처리하기 위해 셀 strainers 또는 기타 contraptions을 사용합니다.
- 샘플 건조 절대 있는지 확인하십시오.
- 우리는 설치 단계에 대한 스테레오 현미경 좋은을 사용합니다. 일방적인 어둠이 빛을 전송 기반을 사용하면 반투명 난소와 하얀 지방이 신체의 대비가 난소를 찾아서 조작으로 쉽게 어디에 우리가 조건을 찾을 수 제기했다.
- 설치에 따라 반복되는.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
IM은 마리 퀴리 다시 통합 교부금에 의해 지원됩니다. 이 작품은 이스라엘 과학 기금 부여 번호에 의해 지원되었다. 1146년부터 1108년까지, 헬렌과 줄기 세포 과학의 웨이즈만 연구소에서 연구 및 레어 자선 재단 마틴 킴멀 연구소.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| 염화칼륨 | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl₂2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl₂2 | Merck & Co., Inc. | ||
| 자당 | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| 인산완충생리식염수 | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| 소 혈청 알부민 분획 V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont 생물학용 핀셋 5 dumstar 연마형 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| 니켈 도금 핀 홀더 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 스테인리스강 미세 핀 (직경 0.1mm, 길이 10mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9웰 플레이트 85X100 mm, 외경 22mm x 깊이 7mm | Corning | 7220-85 | |
| 표준 투과광 베이스 TL ST가 장착된 MZ 16.5 실체 현미경 | Leica Microsystems | ||
| 6-웰 플레이트 | Costar | 3516 | |
| 슬라이드 | 멘젤-글레이저(Menzel-Glaser) | 798 | |
| 커버슬립 | Corning | 2940-223 | |
| 봉입제 | Vectashield | H-1200 | |
| 셀 스트레이너 | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 항체 | 발달 연구 하이브리도마 은행 | ||
| 교통 체증 방지 | Dorothea Godt 박사 연구실 | ||
| 항-Vasa | Ruth Lehmann 박사 연구실 | ||
| 항- β-갈락토시다아제 | 카펠 | ||
| 2차 항체 | Jackson ImmunoResearch |
참고문헌
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
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