생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이미징은 생물 학적 과정을 모니터링하는 데 사용할 수있는 가치있는 기술입니다. 특히, 암 세포, 줄기 세포, 특정 면역 세포 유형, 바이러스 병원균, 기생충 및 박테리아의 존재는 동물 1-2 생활 내에서 실시간으로 따라 수 있습니다. 병원균의 연구에 bioluminescence 이미징의 응용 3-4 동물 모델에서 감염의 분석을 위해 기존의 전략에 비해 장점이 있습니다. 감염은 병원균의 위치와 수량을 결정하기 위해 안락사를하지 않고, 시간이 지남에 따라 각각의 동물 이내 시각하실 수 있습니다. 광학 이미징 오히려 이전에 감염된 것으로 알려져 사이트의 샘플링보다, 모든 조직과 기관의 종합적인 시험을 수 있습니다. 또한, 특정 조직에 접종의 정확성 직접 사전에 실패는 전체 실험에 걸쳐 주사했다 앞으로 동물을 운반하는 결정하실 수 있습니다. 이미지는 각 동물이 개별적으로 따라야하는 수 있기 때문에 동물 사이의 변화가에 대해 제어할 수 있습니다. 이미징 크게 때문에 3-4 병원체 부하를 확인하기 위해 샘플 조직하지 않고 많은 시간이 지점에서 데이터를 얻을 수있는 능력을 필요로 동물의 숫자를 줄일 수있는 잠재력이있다.
이 프로토콜은 루시페라제을 표현하는 박테리아의 재조합 변종에 대한 bioluminescence 이미징을 사용하여 살아있는 동물에 감염을 시각화하는 방법을 설명합니다. 클릭 벌레 (CBRLuc)와 반딧불 luciferases (FFluc)는 기판 5-6로 luciferin을 활용한다. CBRluc와 FFluc 모두에 의해 만들어진 빛이 살아있는 동물 모델 7-9에서 광학 이미징 이러한 luciferases 훌륭한 기자 만들기, 500 nm의 700 nm의 파장에 대한 광범있다. 600 NM보다 빛의 파장은 헤모글로빈에 의해 흡수를 방지하고, 따라서, 효율적으로 포유 동물 조직을 통과하는 데 필요한 때문에 주로이다. 루시페라제는 유전자 빛의 신호 10 생산하는 세균에 소개됩니다. 마우스 실시간으로 감염 모니터링을 허용하는 intratracheally 발광 생물 박테리아와 주사 폐 있습니다. luciferin 주입 후, 이미지가 IVIS 이미징 시스템을 사용하는 인수입니다. 이미징 동안 마우스 XGI - 8 가스 Anethesia 시스템을 사용하여 isoflurane과 anesthetized 있습니다. 이미지가 집중하고 각각의 세균 감염 사이트 (S)과 전화 번호를 나타내는 신호 소스를 수치 분석하실 수 있습니다. 이미징 후, CFU 결정은 박테리아의 존재를 확인하는 균질 조직에서 수행됩니다. 박테리아의 여러 복용은 발광과 세균 숫자를 상관 관계를 규정하는 데 사용됩니다. 이미징은 항균 화합물과 백신의 효능의 pathogenesis 및 평가 연구에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. Intratracheal 삽관법 의한 폐 감염
- 마우스의 무게를하며, 선택, 마르크는 쉽게 식별이 귀에 만들 수 있습니다.
- intraperitoneal 접종하여 마취제 (마우스 중량 g 당 100 μg)과 xylazine (마우스 중량 g 당 10 μg)와 생쥐를 마취.
- 완전히 anesthetized까지 새장에 넣어 마우스. 페달 반응을 확인하기 위해 피트의 패드를 당겨요. 생쥐는 감소하거나 전혀 반사 반응이 표시되어야합니다.
- 그 누워 삽관법 스탠드에 마우스를 놓습니다.
- 삽관법 스탠드에 고무 밴드를 수정 후 마우스의 상단 incisors 아래로 놓으십시오. 다리와 삽관법 스탠드에 무기를 해결하기 위해 테이프를 사용하십시오.
- 부드럽게 집게를 사용하여 입 밖으로 tougue 이동합니다.
- 입 octoscope 내부와 검경를 삽입하고 후두의 오프닝을 볼 때까지 oropharynx 조사.
- catether 허브까지 기관에 cathether으로 덮여 사전 가이드 와이어 incisors에 있습니다. 가이드 와이어를 제거합니다. 가슴 확장을 관찰하고 올바른 삽관법을 확인 cathether에 공기를 넣어.
- 세균의 50 μL를 1 ML의 주사기를....
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토론
이러한 프로토콜을 다음과 같은 일반적으로 고품질 이미지를 얻을 수 있지만, 그것은 영상 연구에서 정확하고 일관된 데이터를 얻기 위해 몇 가지 주요 문제를 고려하는 것이 중요합니다. 발광 이미지는 신호가 배경 위에되고 카메라가 포화되지 않도록하기 위해 600 60000로 카운트를 갖고 취득해야합니다. 얻은 신호 미만 600 경우 노출 조건은 카운트를 증가 조정해야합니다. 얻은 신호가 60,000 이상의 경우 카메라는 일부 지역에서 포화 수 있습니다. 카메라가 포화되면, 부량은 아직 가능하지만, 포화 지역의 시도와 비 포화 지역에 따라 때로는 필요 없을 것입니다. 지역이 재건을위한 마스크에 사용되고있는 지역 내에 포함되어있는 포화 때 또한, 3 차원 재구성 정확하게 진행하실 수 없습니다. 노출 시간의 조정, 비닝 및 F / 정지 영상 취득뿐만 아니라 이미징 지역이나 동물 위치 수정 얻은 신호를 제어 및 데이터의 정량 분석을 허용할 수 있습니다. 따라서, 많은 실험에 이미지 하나 이상의 집합이 정량 분석을 허용하는 데 필요한.......
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공개 사항
동물 연구는 텍사스 A & M 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
저자는 본 연구를 통해 가치있는 토론 및 지원에 대한 시릴 실험실 구성원을 감사드립니다. 우리는이 프로토콜을 찍는 동안 박사와 여호수아 힐과 도움 박사 제임스 사무엘의 실험실 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원에서 빌 & 멜린다 게이츠 재단과 부여 AI47866로부터 부여하여 48,523 후원했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 카테터 (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| 가이드 와이어 | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| 스펙큘럼 포함 옥토코프 | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS 시스템 | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas 마취 시스템 | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging 소프트웨어 | Caliper Life Sciences | ||
| 투명 노즈콘 | Caliper Life Sciences | ||
| 광차단 배플 디바이더 | Caliper Life Sciences |
참고문헌
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
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재인쇄 및 허가
