높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

요약

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

초록

개발, 조직 homoeostasis과 질병을 기본 핵심 프로세스에서 miRNAs의 광범위한 참여가 연구와 제약 공동체 간의 급증 관심되었다. miRNAs을 연구하기 위해서는 microRNA 수준의 부량가 정확하고 안정적​​인 것을 중요합니다. 작은 RNA 부족한 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)에 야생 형 비교하여, 우리는 이전의 출판 멀티 플렉스 qRT - PCR 기술의 정확성과 견고의 부족을 공개했다. 여기, 우리는 극적으로 기술의 정확성과 견고을 증가 singleplex 실시간 감지, 이전 이전 다중화 단계에서 과도한 primers 멀리 정화를 포함하여 최적의 방법을 설명합니다. nanoliter 볼륨에서 microfluidic 칩 기술을 수행하는 방법에 또한, 우리가 설명 크게 시약 비용 절감 및 시간 효율적인 높은 처리량 miRNA 발현 프로 파일링을 수 있습니다.

프로토콜

1. RNA 압축 풀기 : 세포 Monolayer 재배

(TRIzol를 사용하여 제조 업체의 프로토콜을 따라.)

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #
TRIzol 솔루션	Invitrogen	15596-018
이소 프로필 알코올	시그마 - 알드리치	1907-64
클로로포름	시그마 - 알드리치	C 2432
에탄올
RNAse 무료로 물

균질화

1. 주위에 소용돌이 Trizol을 10cm ^두 곳이고 당 1 ML Trizol 솔루션을 추가하여 직접 문화 접시에있는 세포를 균질하고 접시의 전체 범위를 보장하기 위해 아래 피펫합니다.

단계 분리

2. 실온에서 5 분간 균질 견본을 품어.
3. 표시 튜브로 전송, 1ml 당 TrizolSolution 클로로포름의 0.2 ML를 추가하고 15 초 동안 손으로 적극적으로 튜브를 흔들.
4. 3 분 상온에서 알을 품다.
5. 2 15 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 ° C. 원심 분리 후 혼합물은 낮은 붉은 단계 계면와 RNA를 포함하는 무색 위 수성 단계로 분리하여 총 Trizol 솔루션 볼륨의 60 %되어야합니다.

RNA 강수량

6. RNA는 신선하고 표시 튜브로 단계를 포함, 수성을 전송합니다.
7. Trizol 솔루션 1 ML 당 이소 프로필 알코올의 0.5 ML를 추가하여 RNA를 침전.
8. 10 분 상온에서 샘플을 품어.
9. 2 10 분 12,000 XG에 원심 분리기 ° C.

RNA - 세척

10. 원심 분리 후, 튜브의 표면에 뜨는를 삭제.
11. Trizol 솔루션, 와동 1 ML 당 75 % 에탄올의 최소 1 ML을 추가하여 RNA 펠렛을 (튜브의 측면과 하단)를 씻으십시오.
12. 2 5 분 7,500 XG에 원심 분리기 ° C.

RNA 용리

13. 뜨는을 취소하고 1 분 다시 원심 분리기. 과도한 액체를 제거합니다.
14. 50~10분을위한 공기 건조 펠릿.
    참고 : 건조 RNA 이상은 solubilize하기가 어렵습니다.
15. 위 아래로 솔루션을 pipetting하여 RNase 무료로 물에 펠렛을 Redissolve 55시 10 분 품어 ° C.
16. Nanodrop ™의 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도 (A260/280 비율)을 측정합니다.
17. -80 사용할 ° C까지 준비에 보관하십시오.

2. RNA - 추출 : 세럼

(다음 mirVana 파리 키트 제조 업체의 프로토콜 미첼 외에 의해 수정되었습니다. ¹⁾

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #	댓글
미러 바나 파리 키트 2X Denaturing 솔루션 산성 - 페놀 : 클로로포름 miRNA 와시 해결 방법 1 miRNA 와시 솔루션 3분의 2	앰비온	AM1556	수정된 프로토콜
2 - 메르 캅 토 에탄올	시그마 - 알드리치	M7522
에탄올
DEPC 물을 치료

화학 준비 :

• 2X Denaturing 솔루션 2 - 메르 캅 토 에탄올의 375 μl를 추가하고 잘 섞는다.
• miRNA 세척 솔루션 1~100% 에탄올 21 ML을 추가합니다.
• miRNA 와시 방법 2 / 3 100 % 에탄올 40 ML을 추가합니다.

샘플 준비 :

• 얼음 혈청 샘플을 해동.

균질화

1. 동등한 2X Denaturing 솔루션의 볼륨 (300 μl) (실온에서해야합니다)와 와동 300 μl 샘플을 섞는다.
2. 5 분 얼음 혼합물을 품어.
3. 산성 - 페놀의 볼륨을 추가 샘플 lysate 플러스 2X Denaturing 솔루션 (600 μl)의 전체 볼륨에 동등한 클로로포름.
   중요 : 클로로포름 : 산성 - 페놀 위에 자리잡고 수성 버퍼를 사용하지 마십시오.
4. 60 초 동안 와동 혼합물.
5. 최대 속도 (> 10,000 XG)에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리기. 원심 분리 후 혼합물은 위 수성 단계, 계면 및 낮은 유기적인 단계로 분리시킵니다.
6. aque를 제거위에 ous 레이어 (300해야합니다 - 어떤 proteinacious "헤이지"레이어를 포함하여 500 μl).
7. 다시 추출 다시 클로로포름을 추가하여 이전처럼 수성 층.
   중요 : 두 번째 추출의 수성 층 (250 μl) 볼륨에서 일상적으로 작습니다. 볼륨이 회복됩니다.

최종 RNA - 절연 (총 RNA)의 준비

• 사전 가열 (95 ° C) nuclease없는 물.
• 100 % 에탄올은 실온에서해야합니다.

최종 RNA - 절연 (총 RNA)

8. 복구 수성 단계 (예 : 300 μl가 발견했다면, 375 μl 에탄올 추가) 100 %의 에탄올의 1.25 볼륨을 추가하고 철저히 섞는다.
9. 각 샘플은 수집 튜브 중 하나에 필터 카트리지를 넣으십시오.
10. 필터에 lysate를 피펫.
11. 원심 분리기는 (10,000 XG) 30 초 동안, 흐름을 통해를 버리고 30 초 동안 다시 원심 분리기와 같은 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 교체하십시오.

RNA - 와시

12. 15 초 동안 필터 카트리지 및 원심 분리기에 700 μl miRNA 와시 해결 방법 1을 적용 수집 관의 흐름을 통해 삭제하고, 동일한 수집 관에 필터 카트리지를 교체하십시오.
13. 흐름 -을 통해를 버리고 와시 방법 2 / 3의 두 번째 500 μl와 반복, 15 초 동안 500 μl miRNA 와시 방법 2 / 3, 원심 분리기를 적용합니다.
14. 1~2분에 대한 흐름을 통해 건조 - 스핀을 폐기하십시오.
15. 새로운 컬렉션 튜브에 넣어 필터 카트리지, 100 μl RNAse 무료 물 (95 ° C), 2 분 가까이 뚜껑과 부화를 적용할 수 있습니다.
16. RNA를 복구할 ~ 2 분 동안 원심 분리기.
17. -80 ° C에서 보관 사용까지.

3. RNA - 솔루션의 농도 (배)

(제조의 프로토콜에 따라)

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #
MICROCON 원심 필터 장치, Ultracell YM - 3	Millipore	42,404
DEPC 물을 치료

장치 : Microcon Ultracell YM - 3, 커토프 SS와 DS의 세포핵 : 10

볼륨 : 다시 집중 RNA 솔루션의 희망 량은 실험 설계에 의존하고 제어 실험을 포함해야합니다.

1. 저수지에 유리병과 피펫 솔루션에 Microcon 샘플 저수지를 삽입합니다.
   참고 : 멤브레인를 만지지 마십시오.
2. 4 185분을위한 원심 분리기 ° 최대​​한의 14000과 C X G.
   참고 : 회전자 방향 균열 밴드와 함께 위치 유리병.
3. 저수지에 RNAse 무료 물을 피펫 원하는 볼륨 (예 : 20 μl), 장소 저수지 4 3 분 새로운 유리병과 스핀으로 바뀌 ° C 최대한의 3000 X G. 함께
4. -80 ° C에서 보관 사용까지.

4. 역방향 전사

(수정 당나라 외하여 프로토콜. ² 다음.)

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #	댓글
고용량 cDNA 아카이브 키트 10X cDNA 보관 버퍼 dNTP (100 ㎜) 몰로니 murine의 백혈병 바이러스 (MMLV) transcriptase를 (50 U / μl) 반대	응용 Biosystems	4,368,814	수정 프로토콜
RNaseOUT (40 U / μl)	Invitrogen	10777019
X - 플렉스 역방향 줄기 루프 프라이머 믹스 (40 NM) *	통합 DNA 기술	사용자 정의	시퀀스 *
DEPC 물을 치료

반응 볼륨 : 5.5 μl

참고 : 줄기 루프 primers의 최종 농도가 1-5 nm의 (여기서는 두 NM)해야합니다.

다음과 같이 마스터 믹스 (반응 당 볼륨) 준비 :

1. DEPC - 워터	1.959 μl
2. RT - 버퍼 10X	0.55 μl
3. RNase 억제제 (40 U / μl)	0.0715 μl
4. dNTP (100 ㎜)	0.275 μl
5. X - 플렉스 역방향 줄기 루프 프라이머 믹스 (40 NM) *	0.275 μl
6. MMLV - RT (50 U / μl)	0.369 μl

7. 미x 및 원심 분리기의 짧게.
8. 2 μl 예제로 마스터 믹스 3.5 μl를 추가합니다.
9. 다음과 같은 RT - 반응을 수행 :
   20 60주기에 의해 다음 30 분 동안 16 ° C, 각하 30 초 동안 C, 42 ° 30 초 동안 C, 50 ° 일초 마침내 85 C ° MMLV - RT, 4 inactivate 5 분 C ° C ∞ .
10. 사용하기 전까지 -20 ° C에 보관하십시오.

역방향 줄기 루프 primers의 * 목록에서보실 수 있습니다 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

5. 사전 증폭 (사전 PCR)

(수정 당나라 외하여 프로토콜. ² 다음.)

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #	댓글
dNTP (100 ㎜)	응용 Biosystems	4,368,814	하이 캡. cDNA 보관 키트.
NoAmpErase 엉와 배 범용 PCR 마스터 믹스	응용 Biosystems	4,324,018
X - 플렉스 포워드 프라이머 믹스 (450 NM) *	통합 DNA 기술	사용자 정의	시퀀스 *
유니버설 역방향 프리머 (100 μm의)	통합 DNA 기술	사용자 정의	순서 2
AmpliTaqGold 효소 (5 U / μl)	응용 Biosystems	4,311,806
MgCl 2 (100 ㎜)
DEPC 물을 치료

반응 볼륨 : 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT - 제품)

참고 : 사전 증폭은 RNA의 시작 농도가 제한 특히, 신호의 강도를 향상시키기 위해 필요합니다. 입력 RNA 수준은 사전 PCR 사이클의 최적의 수를 결정합니다. 같은 상대적인 효율성을 감안할 때 각 PCR주기는 최종 제품의 농도를 두 번한다. 일부 miRNAs 더 높은 표현되기 때문에, 사이클링 이상하지 마십시오. 그러나, 아래 - 증폭은 특히 낮은 수준에서 표현 microRNAs 들어, 검출 감도의 손실이 발생할 수 있습니다. 우리 손에 총 RNA의 100ng을 사용하여 12 미리 증폭 사이클, 충분한 나타났다. 시작 소재, 감지 miRNA 수준 12 사이클 결과지만, 15 사이클이 우수한 것으로 나타났다으로 혈청을 사용합니다. 마지막으로, 3 oocytes (oocyte ³ 당 약 400 PG 총 RNA), 16 미리 증폭 사이클로 시작이 성공적으로 microRNA 표현 수준 ⁴ 화면 ^{우리에게있었습니다.}

앞으로 primers의 * 목록에서보실 수 있습니다 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

다음과 같이 마스터 믹스 (반응 당 볼륨) 준비 :

1. 2X 범용 MM	13.75 μl
2. DEPC - 워터	0.792 μl
3. MgCl 2 (100 ㎜)	0.55 μl
4. dNTP (100 ㎜)	1.1 μl
5. X - 플렉스 포워드 프라이머 믹스 (450 NM)	3.06 μl
6. 유니버설 RP (100 μm의)	1.375 μl
7. AmpliTaqGold 효소 (5 U / μl)	1.375 μl

8. 믹스와 간단히 원심 분리기.
9. 각 5.5 μl RT - 제품 22 μl 마스터 믹스를 추가합니다.
10. 다음과 같은 사전 PCR 반응을 수행 :
    10 분 95 ° C, 55 ° 2 분에 대한 C, 10 다음 - 1 S 65 95 ° C 18 ° C주기 1 분, 4 ° C ∞.

6. 사전 PCR 제품의 정제

10 % 기본 polyacrylamide 젤의 크기를 선택하여 정제

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #
40% 아크릴 아미드 / BIS 솔루션	바이오 래드	161-0144
TEMED	바이오 래드	161-0801
10 BP의 DNA 사다리	Invitrogen	10821-015
SYBR 골드 핵산 겔은 얼룩 DMSO 10,000 X 집중	Invitrogen	S11494
글리코겐 (20 MG / ML)	로체	10 901 393 001
버퍼 EB
10 % Ammoniumpersulfate (APS)
TEN - 버퍼
배의 오렌지 G
DEPC 물을 치료
ddH2O

A. 젤 준비

10 % polyacrylamide 혼합물 추가의 10ml하려면

1. ddH 2 O	6.5 ML
2. 10X TBE	1 ML
3. Polyacrylamide (40 %)	2.5 ML
4. APS (10 %)	80 μl
5. TEMED	4 μl

6. DNA의 사다리를 준비 :
   • 0.5 μl 10 BP의 DNA 사다리
   • 4.5 μl 버퍼 (EB)
   • 1 μl 배의 오렌지 G
7. 각 27.5 μl 사전 PCR 제품 5.5 μl 배의 오렌지 G를 추가합니다.

B. 젤을 실행

8. 55-60분위한 150V로 젤을 실행합니다.
   참고 : 표시로 Bromophenol 파란색 20bp 지역과 함께 실행됩니다.

C. 젤 스테인

9. 흔드는 25 분 SYBR - 골드와 젤 얼룩.
   참고 : SYBR - 골드 민감한 빛입니다.

D. 젤 컷

10. 60-80 BP에서 사전 PCR 제품의 밴드를 잘라 표시 튜브로 전송할 수 있습니다.
    참고 : 낮은 RNA 입력 사전 PCR 제품에 대한 밴드가 표시되지 않을 수 있습니다.
11. 겔 밴드 (튜브 원심 분리의 예 튜브)를 크러시.

E. 다시 추출 cDNA

12. 300 μl 추가 37 TEN - 버퍼와 부화 ° 회전 4 시간 동안 C.
13. , 라벨 수집 튜브에 액체를 전송 젤 함유 튜브 10 - 버퍼 또 다른 300 μl를 추가하고 4 모두를 품어 ° C 회전에서 하룻밤.
14. 남은 액체를 대기음, 라벨 수집 튜브 전에로 전송하고 전체 복구 볼륨을 확인합니다.

F. 에탄올 강수량

15. 상온 100 % 에탄올 3 볼륨을 추가합니다.
16. 0.5 μl 글리코겐 (20 MG / ML) 추가합니다.
17. 와동.
18. 최소한 2 시간 동안이나 ° C 야간 -80에서 드라이 아이스에 품어.
19. 펠렛 cDNA 30 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 스핀.
20. 액체를 덤프, 700 μl 실온 10 분 동안 75 % 에탄올과 스핀을 추가합니다.
21. 액체를 덤프하고 5 분 다시 스핀.
22. 10 분 펠렛 공기 건조를 방해하지 않고 표면에 뜨는를 빨아.
23. 깨끗한 물에서 펠렛을 Redissolve.

참고 : 집중 cDNA 솔루션 원하는 볼륨이 실험 설계에 의존하고 제어 실험을 포함해야합니다.

7. 사전 PCR 제품의 정제

primers의 효소 소화에 의해 정화가 (제조 프로토콜 다음) 스핀 열의 다음

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #
ExoSAP - IT	USB - Affymetrix	78,250
MinElute PCR의 정제 키트	Qiagen	28,004

참고 : 우리 손에 독점적인 효소 청소 성공적으로 제거 primers도 온도 ° C의 불활 성화의 단계에서 80까지 상승하는 등 짧은 제품의 denaturing 가능성으로 인해 일부, 미리 증폭 제품의 부분적인 저하로 이끌었지만, 효소. 열 불활 성화를 피하고 직접 스핀 컬럼을 사용하여 효소 반응에서 PCR 제품을 정화하는 것은 제품의 저하없이 뇌관을 제거합니다.

1. 2 μl ExoSAP - IT 5 μl PCR 후 제품을 섞는다.
2. 37 품어 ° C를 나머지 primers와 세포핵이 저하될 15 분.
3. 내가 PB 버퍼에 추가되었습니다 산도 표시하는 경우, PCR 반응과 혼합 1 볼륨의 버퍼 PB 5 볼륨을 추가 혼합물의 색깔이 노란색 있는지 확인합니다.
4. 적당한 선반에서 제공하는이 ML 수집 관에 MinElute 열을 삽입합니다.
5. 1 분 MinElute 열 및 원심 분리기에 샘플을 적용합니다.
6. 흐름 -을 통해 폐기, 같은 튜브로 다시 MinElute 열을 장소와 1 분 세척 및 원심 분리기에 MinElute 컬럼에 750 μl 버퍼 PE를 추가합니다.
7. 흐름 -을 통해 취소하고 같은 튜브에 MinElute 열 다시 넣으십시오. 최대 속도에서 추가로 1 분 칼럼을 원심 분리기.
8. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 MinElute 열의를 놓습니다.
9. DNA를 elute하려면 센 후, 멤브레인의 중심 10 μl DEPC 처리된 물을 추가 컬럼 1 분 서서하게하고,1 분 trifuge.

8. Fludigim 96.96 qRT - PCR의 프로파일

시약의 이름	회사	/ 캣 생산성 #	댓글
플루 96.96 동적 배열 키트 96.96 동적 배열 96.96 제어 라인 유체 20x 로딩 시약	플루 코퍼레이션
의 혼합 유니버설 리버스 프라이머 (1 μm의) 앞으로 프리머 (1 μm의) TaqMan 프로브 (0.2 μm의)	통합 DNA 기술	사용자 정의	순서 (1)
2X PCR 유니버셜 마스터 믹스 NoAmpErase 엉로	응용 Biosystems	4,324,018
트윈

1. 마중물 96.96 동적 배열 IFC에게

1. 칩 accumulators의 각으로 제어 라인 유체 (150 μl)을 주사.
2. 장소 IFC (통합 유체 회로) 컨트롤러로 칩 및 칩으로 주요 제어 라인 유체에 프라임 (136x) 스크립트를 실행합니다.

참고 : 칩이 패키지를 여는 후 24 시간을 사용해야합니다. 칩이나 인레츠의 제어 라인 유체가 칩을 사용할 수 없게 만드는 것이므로 컨트롤 라인 액체를 유출하지 않도록하십시오. 칩은 프라이밍 60 분 이내에로드해야합니다.

2. 샘플 준비

2.1 사전 샘플 준비

일회용 플라스틱 튜브에 샘플 - 사전 믹스 (입구마다 볼륨)하기 위해 아래의 테이블의 구성 요소를 결합.

2X TaqMan 유니버셜 마스터 믹스	2.5 μl
20x 로딩 시약	0.25 μl

참고 : 피펫에 대한 없더군요가 손실을 분배 등 최종 볼륨이 2.75 μl입니다

2.2 샘플 준비

물론 사전에 샘플 믹스 (입구마다 볼륨) 각 샘플을 포맷합니다. 96 컴바인

사전 샘플 - 혼합	2.75 μl
견본	2.25 μl

참고 : 간단히 유체를 수집하는 소용돌이와 원심 분리기 96 잘 판.
입구 5 μl 당 최종 볼륨이 약간 더 높은 볼륨을 준비하여 계좌에 손실을 pipetting 가져가라.

13x Assays 준비 2.3

1. 13x assays를 준비하는 96 잘 접시를 사용합니다. 아래 표에 1X 농도는 13x에 스케일.

유니버셜 역방향 프리머	1 μm의 (1X)	2 순서
앞으로 프리머 *	1 μm의 (1X)	*
유전자 특정 TaqMan 프로브 #	0.2 μm의	#

앞으로 primers의 * 목록에서보실 수 있습니다 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

TaqMan 프로브의 # 목록에서보실 수 있습니다 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm

2. 0.25 % 최종 트윈 농도에 대한 트윈과 13x assays의 새로운 96 잘 플레이트 aliquots에 통합
   참고 : 입구마다 최종 볼륨이 계정으로 볼륨 전송 중에 손실을하기에 충분한 볼륨 (5.5 μl)를 준비, 5 μl입니다.
3. 잘 섞어 거품을 피하고 및 유체를 수집하기 위해 간단히 원심 분리기.

3. 칩 로딩

참고 : 샘플 assays 칩의 정확한 위치를 보장 올바른 로딩을 허용하기 위하여. 그것은 왼쪽 상단 모서리에 노치를 정렬하는 것이 편리합니다.

모든 검정을 확인하고 샘플 솔루션은 칩을로드하기 전에 혼합하고 있습니다. 그것은 96 잘 판에 이렇게하고 칩로드하기 전에 접시를 회전하는 것이 편리합니다. 나중에 참조할 수 있도록 칩 pipetting지도의주의하십시오.

사용하지 않는 샘플 인레츠은 2.75 μl 샘플 믹스와 2.25 μl DNA 무료로 물이 가득해야합니다.

사용하지 않는 검정 인레츠은 2.5 μl 분석 로딩 시약 및 2.5 μl 물로 채워져 있어야합니다.

공기 방울을 도입 피하기 위해 pipetting 동안 최초의 정지 과거 가지 마라.

1. 샘플 assays (V 로딩 후입구마다 olume : 5 μl)는 칩에 샘플 assays를 로드할로드 믹스 스크립트 (136x) 스크립트를 실행합니다.
2. 스크립트가 완료되면 ICF 컨트롤러에서 칩을 제거합니다.
3. 로드된 칩의 아래쪽에서 파란색 보호 필름을 벗겨내는 거지.
4. 칩 표면의 모든 먼지 입자이나 먼지를 제거합니다.

4. 96.96 qRT - PCR

1. 바이오 마크 시스템에 칩을 전송하고 다음 증폭 조건을 사용
   55 ° 2 분, 95 ° C 15 s와 55 ° C 1 분 95 ° C의 40주기에 의해 다음 10 분 C.
2. 소프트웨어를 데이터 수집을위한 생산의 프로토콜을 수행합니다.

5. qPCR 분석 소프트웨어를 사용

RT - PCR 후 독점 소프트웨어는 각 웰에 대한 증폭 곡선, 열지도 및 CT 값을 제공합니다. 데이터 분석을위한 소프트웨어 설명서를 참조하십시오.

9. 대표 결과 :

그림 1. 실험 워크플로우의 도표 표현. 표시하기 전에 다중 역방향 전사 (단계 C) 및 멀티 플렉스 preamplification에서 과도한 primers의 정화 (단계 E) (D 단계)를 포함한 멀티 플렉스 qRT - PCR 프로토콜의 단계별 설명입니다 실시간 탐지 (단계 F)는 qRT - PCR을위한 정화 cDNA 템플릿의 결과. FP : microRNA 특정 앞으로 입문서, URP : 유니버셜 역방향 프라이머, R - SLP : microRNA 특정 역방향 줄기 루프 입문서.
더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. . 사전 PCR 제품의 크기를 미리 PCR 밴드 후 qRT - PCR 템플릿의 Polyacryamide 젤 정화는 독점적 WT 샘플을 볼 수 있지만 microRNA 결함 DGCR8에 ^{- / -} 또는 주사위 놀이를하는 사람 ^{- / -} 샘플 (화살표) 이후 96 플렉스 RT와 preamplification 12 사이클. 원인 불명 (화살촉)과 과도한 primers가 아닌 특정 제품이 모든 샘플 (별)에서 발견됩니다.

그림 3. 멀티 플렉스 preamplification 후 정제는 크게 qRT - PCR 결과의 정확도를 향상 WT mESC의 상대적인 표현 수준의) 비교 Dgcr8에 ^{-. / -} (표준 microRNA 결함) mESC 더 microRNAs 1) 감지 및 잘못된 긍정 2) 손실을 공개 사전 PCR 제품의 primers 멀리 정화 후 배경 ^{- / -} Dgcr8에 신호. B) 정화 후, 두 ^DGCR8의 상대적 표현 수준 ^{- / -} / _WT와 ^{주사위 놀이를하는 사람 - / -} / _{WT 거짓} 긍정적인 신호의 손실을 표시하고 희귀한 Dgcr8 독립 / _{주사위 놀이를하는 사람에} 의존 작은 RNAS의 적절한 분류 (미르 - 320에 대한 허용 - 484, -877) ^5.

그림 4. 플루 높은 처리량 qRT - PCR의 miRNA 프로 파일링. 예를 들어 화면이 전립선 암 환자 세라의 miRNA 수준의 변용에 대해 화면으로 96.96 플루 qRT - PCR mircoRNA 프로 파일링의 쐈어. 실시간 qPCR 분석 소프트웨어는 증폭 곡선, 색상 코드 열지도 및주기 임계값 (CT)를 제공합니다.

토론

miRNAs가 짧고 (18-24 세포핵), 비 코딩 모두 약화 메신저 RNAS (mRNA)와 억제 자신의 번역에 의해 게시 - transcriptionally 유전자 발현을 조절 RNAS을 ^{6. 인간} 유전자 중 최소한 한 세 번째 보존 포함 사실 miRNA 자신의 3'UTR에 바인딩 - 사이트 및 pluripotency, 증식 및 apoptosis에 대한 유전자 miRNAs의 뚜렷하지 상호 작용은 세포의 운명 결정, 조직 항상성 및 암 같은 질병에 중요한 기여를 제안합니다. ^6,7 따라서 정확한 microRNA 표현 프로파일은 확장의 아르 관심.

qRT - PCR의 miRNA 발현 프로 파일링 프로토콜 ² 출판 멀티 플렉스를 테스트하려면 우리는 부정적인 컨트롤로 작은 RNA 결함 mESC를 사용합니다. ^{/ - -} DGCR8 ^{- / -} 주사위 놀이를하는 사람 중에 세포는 모든 정식 microRNAs의 결함입니다. 세포는 정식이 아닌 canoncial 모두 micoRNAs 부족 ^8,9

^{/ - -} DGCR8 MES 대 야생 유형의 수준을 비교 세포를, 우리는 몇 가지 ¹⁰ microRNAs는 야생 형 세포 ¹¹ 발견되지 않은 표현으로 정확성 부족을 밝혀. 일부는 심지어 녹아웃 세포 (그림 3A)에 비해 낮은 표현 수준을 보여주었다. 우리는 정확성의 부족은 singleplex RT - 부량 전에 연속 2 멀티 플렉스 단계의 대규모 뇌관 이월 (RT 및 Pre - PCR)에 의한지도 모른다고 가상. 그러나, 멀티 플렉스 사전 증폭은 RNA의 시작 농도가 제한 특히, 신호의 강도를 향상시키기 위해 필요합니다. ^{/ - -} 원시 polyacrylamide의 젤 (그림 2)에서 크기를 선택하여 primers에서 사전 PCR 제품을 멀리 정화함으로써, 우리는 Dgcr8 모두에서 더 많은 microRNAs과 거짓 긍정적인 신호의 손실을 감지하여 정확성에 상당한 개선을 보여주는 수 있으며, 주사위 놀이를하는 사람 ^{- / -} 또한 배경 (인물 3A 및 3B) 희귀 Dgcr8 독립 / _{주사위 놀이를하는 사람} 종속 작은 RNAS (그림 3B) ^11의 적절한 분류에 허용되는 변경 qRT - PCR 방식. 따라서 멀리 사전 PCR 제품의 과도한 primers를 정화하기 위해 추가 단계는 대형 멀티 플렉스 프라이머를 사용하면 예제마다 집합 특히, 명확하게 유리한 것입니다.

사전 증폭 사이클의 최적의 번호는 입력 RNA의 농도에 의해 결정됩니다. 하지 미만 또는 균형 overamplify는 특정 실험의 세부 사항으로 안내한다.

이상 천 알려진 microRNAs를 통해 표준의 사용 384 잘 복수의 샘플을 비교 특히 접시가 광범위한 microRNA 프로 파일링 최적되지 않을 수 있습니다. 플루 동적 배열 IFC는 nanoliter 규모 (6.7 NL)에서 하나의 실험 (9,216 반응)에서 96 가지 microRNAs에 대해 96 개인 샘플까지 테스트, pipetting 단계와 필요한 화학 상당한 감소와 수 있습니다. 각 실행에 대한 분석 소프트웨어는 증폭 곡선, 색상 코드 열지도 및 사이클 임계값 값 (CT)를 제공합니다. 동시 대규모 프로 파일링은 실험 차이를 줄여 작은 RNA 컨트롤을 사용하게 다른 정상화 전략을 밖 수행 의미 표현 값 정상화에 대한 수 있습니다. ¹²

미리 할당된 TaqMan 프로브와 함께 상용 384 잘 플랫폼에 비해, 사용자 정의 만든 프라이머 세트와 높은 처리량 프로 파일링 플랫폼의 조합은 높은 실험 유연성을 제공합니다.

동적 배열 플랫폼과 함께 최적화된 멀티 플렉스 qRT - PCR 방법은 성공적으로 우리는 동시에 384 miRNA (그림 4)의 수준에서 변경 48 전립선 암 환자 세라를 화면과 컨트롤의 증가 (즉, 합성 microRNAs)없이 데이터를 정상화 수있었습니다. ¹¹

샘플 준비의 프로 파일링 결과 단계의 증가에도 불구하고, 설명하는 방식도 제한 시작 소재, 시간 및 miRNA 발현 수준에 대한 큰 샘플 세트를 프로필에 비용 효율 높은 처리량 방법입니다.