방법 논문

사전 이식 유전자 진단 생선

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DOI:

10.3791/2570

⸱

2011년 2월 23일

 ,  , 
1Department of Cytogenetics, GSTS-Pathology, Guy’s & St Thomas’ NHS Foundation Trust, Guy’s & St Thomas’ Centre for Preimplantation Genetic Diagnosis

이 논문에서

요약

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

초록

사전 이식 유전 진단 (PGD)은 사전 산후 진단하기 위해 설립된 대안이며, 보조 생식 기술 (ART)에 의해 생성된 일대에서 미리 주입 배아를 선택 포함됩니다. 이 선택 때문에 가족 monogenic 질환 (예 : 낭성 섬유증)의 요구, 혹은 파트너가 염색체 다시 정리하기 (예 : 양방향 상호의 translocation) 수행하기 때문에 수 있습니다. PGD​​는 염색체 rearrangements, 재발성 유산이나 불임의 경우에는 이전의 영향을받는 아이가, 그리고 / 또는이 커플에 사용할 수 있습니다. Oocytes는 다음과 난소 자극이 정액의 체외의 집중 (IVF)에 의해 또는 개별 정자 (ICSI)의 intracytoplasmic 주입에 의해 수정된 아르 aspirated. 사전 주입 절단 단계의 배아는 보통 3 일 후 수정에 대한 단일 세포의 제거에 의해 biopsied 있으며, biopsied 세포는 배아의 유전자 상태를 설정하는 테스트입니다. 대상 - 특정 DNA 프로브와 함께 biopsied 세포의 고정 핵에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광가있는 X - 링크된 질환과 염색체 rearrangements과 관련된 염색체 불균형을 감지하고, 가족 여성 배아를 선택하는 선택의 기술이다 더 돌연변이없는 특정 테스트합니다. 물고기도 지원 복제의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 자발적인 염색체 aneuploidy (또한 PGS 또는 PGD - AS라고도 함)에 대한 화면 배아하는 데 사용되었습니다 있지만, 확산 및 생선 기술을 사용하여이 검사의 예측 가치는 여기에 설명된 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브리드화에서 임상 환경에서 PGD에 적용 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

프로토콜

1. Lysing 및 Biopsied Blastomere에서 핵 스프 레딩

  1. 확산 셀 (0.01 M HCL의 0.2 % Tween20, 산도 2.0)에 대한 세포 용해 버퍼는 사전에 24 시간 준비하고 -20 ° C.에 보관해야 멸균 20 ML의 주사기와 주사기 필터를 사용하여 30 ML 살균 보편적인 컨테이너로 100 ML 및 필터 20 ML을 준비합니다. 10-15 1.7 ML 살균 microcentrifuge 튜브에 1 ML aliquots 하는걸 닫기 사전 동결에 튜브 라벨. 이것은 새로운 배치가 만족스럽지 않은 경우 테스트되었으며 사용할 수있는 사용하는 것입니다 두 개의 다른 배치, 새로운 배치하고 이전 배치를하도록 권장합니다.
  2. 서리를 없애다 30 분쯤 생검 절차 전에 상온에서 용해 버퍼. 실용적인 목적을 위해 작동 온도가 실내 온도와 손 온도 사이 여야합니다.
  3. 다이아몬드 펜 및 Pre - 라벨 사건 번호, 고유 슬라이드 번호 및 생검 날짜와 슬라이드를 사용하여 아민 - 코팅 슬라이드 (예 : Genetix)의 아래쪽에 작은 원을 (약 5mm 직경) 점수. 별도의 숫자 순서대로 각 blastomere에 대한 슬라이드 및 배아 번호 라벨을 사용합니다. 슬라이드는 같은 4H로 열심히 연필로 표시하고, 모든 흑연 먼지를 제거하는 라텍스 장갑과 함께 "blotted"해야합니다.
  4. 원 안에 용해 버퍼의 작은 볼륨을 넣으십시오.
  5. 용해 버퍼에 biopsied blastomere을 전송합니다. 셀 lyse 시작할 때까지 필요한 동그라미 안에 용해 버퍼를 추가하는 경우, 전지가 완전히 lyse해야하며 세포질은 버퍼 증발하기 전에 분산.
  6. 그것은 원 안에 남아 손실되지 않도록하기 위해 핵을 관찰, 세포는 핵을 가지고 또는 여러 개의 핵을 가지고하지 않는 경우, 다른 세포를 생검.
  7. 상온에서 공기 건조에 슬라이드를 둡니다.

2. 단일 Blastomere 핵의 원위치 하이브리드화에서

  1. 멸균 증류수에 만든 에탄올 시리즈 (70, 90 및 100 %) 준비합니다.
  2. 전원을 켜고 75 핫 블록 (예 : Hybaid Omnislide 또는 Vysis Hybrite)을 설정 ° C.
  3. 서리를 없애다 프로브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기. 시약은 목격하고 프로브 혼합물을하기 전에 정확하게 확인해야합니다. 피펫 0.65 ML 살균 microcentrifuge 관 및 사용하기 전에 와동과 원심 분리기에 프로브 혼합물을 만들기 위해 제조 업체가 지정한 볼륨. 프로브 혼합물의 총 부피는 핵 당 2 μL를 테스트하고 안전 마진을 허용하는 가장 가까운 10 μL로 반올림 수 있도록 충분해야합니다.
  4. 상온에서 5 분. : 사용 인산염 버퍼 호수 (PBS) (0.14 M NaCl, 3 MM KCl, 10 MM 나 2 HPO 4 2 MM KH 2 PO 4 산도 7.0) 코플린 단지에있는 슬라이드를 미리 씻어
  5. 멸균 증류수에 두 슬라이드를 씻어.
  6. 실내 온도와 공기 건조 2 분 각 에탄올 시리즈 (70, 90, 및 100 %)으로 슬라이드를 탈수. 확인 슬라이드 완전히 포장되어 및 흑연 먼지가 표면에 떠다니는 경우, 깨끗한 휴지로 흠뻑 젖어 있습니다.
  7. 위상 콘트라스트 현미경으로 시각화하여 원 안에 핵의 위치를​​ 기록합니다.
  8. 실내 온도와 공기 건조 2 분 100 % 에탄올로 탈수.
  9. 프로브 혼합물 2 μL를 적용하고, 9 X 9mm coverslip (18 X 18mm 제일 coverslip의 사분의 일)으로 커버.
  10. 고무 시멘트 (; 코 교정 예 코 껌)와 coverslip의 가장자리를 밀봉합니다.
  11. 75 뜨거운 블록에 슬라이드를 Codenature ° 후 5 분 C 및 37에서 humidified 챔버에서 (16-20 H) 하룻밤 사이에 슬라이드를 잡종 ° C. centromere 프로브 (섹스 연결된 경우에 IE)의 전체로 구성 프로브 혼합은 하이브리드화 60 분 후에 만​​족스러운 결과를 줄 것이다.
  12. 71 충분한 코플린 단지와 열 ° C.있는 물 목욕 준비
  13. 0.4x 표준 호수 구연 산염 (SSC) 엄격한 세척 솔루션 (71시 산도 7.0 ° C, 0.06 M NaCl, 6 MM C 6 H 5 나 3 O 7 0.2 H 2 O)과 물 목욕으로 더위를 준비합니다.
  14. 필요한 코플린 항아리마다 엄격한 씻어 50 ML 하는걸하고 온도가 71되었는지 확인 ° C 즉시 깨끗한 온도계를 사용하여 사용하기 전에.
  15. 조심스럽게 각 슬라이드에서 고무 시멘트를 제거하고 실온에서 4X SSC/0.05 % Tween20 (산도 7.0)를 사용하여 coverslip을 씻어.
  16. 71에서 0.4x SSC 엄격한 세척에 슬라이드를 씻어 ° C를 5 분. 코플린 병 당 6 개 이상의 슬라이드도 씻으십시오 없습니다.
  17. 2 분 실온에서 4X SSC/0.05 %의 Tween20에서 슬라이드를 씻으십시오.
  18. 프로브 믹스가 간접적으로 표시된 프로브 (S)를 포함하는 경우, 초과 액체의 슬라이드를 분출과 Parafilm의 20 X 20mm 광장 아래의 찬란 복합 항체의 20 μL를 적용합니다.
  19. 37 humidified 챔버에 품어 ° C를 15 분.
  20. Parafilm를 제거 2 분 실온에서 한번 4X SSC/0.05 %의 Tween20에 씻으십시오.
  21. PBS 2 분 두 번 씻어t 룸 온도와 슬라이드를 물기.
  22. 아니 22 X 22mm에 DAPI / Vectashield (4 160 NG 'Vectashield 설치 매체 벡터 연구소 1 ML에서, 6 diamidino - 2 - phenylindole dihydrochloride) 6 μL을 적용합니다. 0 coverslip 및 coverslip 위에 슬라이드를 반전.
  23. 얼룩과 맑은 손톱 바니와 coverslip의 가장자리를 밀봉.

3. 형광 현미경을 사용하여 분석 적절한 사용 프로브에 대한 적절한 필터를 탑재.

  1. 형광 현미경 및 분석의 각 fluorochrome 단일 대역 통과 필터를 사용하여 직접 시각화하여 점수 신호. 각 핵은 두 분석가에 의해 득점해야합니다. 일반적인 지침은 두 붙어있는 신호가 떨어져 미만 도메인 (신호 폭)하는 단일 신호의 점수로 연결되어야하지만, 경험을 바탕으로 판단 크기, 강도를 변화의 신호와 분리를 해석하는 행사해야합니다.
  2. 이미징 소프트웨어 (예 : 이시스, MetaSystems, Altlussheim, 독일, CytoVision, Genetix)를 사용하여 영상 진단의 확인에 대한 핵의 이미지를 캡처하고, 실험실 품질 보증 계획의 일환으로 아카이빙 이미지.

4. 대표 결과 :

Metaphase 및 교양 말초혈 lymphocytes에서 계면 핵이 선택한 프로브는 중단점 (subtelomere 프로브의 중심에 translocated 세그먼트와 centromere 프로브 (S)에만 잡종을해야합니다에 대한 유익한 정보, translocation 염색체 특정되었는지 확인하기 위해 검사해야합니다 세그먼트 (S)) 및 계면 핵의 신호는 밝고 이산해야합니다. 각 파트너에서 100 계면 핵의 각 프로브에 대한 신호의 숫자를 채점하는 것은 분석의 효율성을 평가하는 것이 좋습니다. 이 경우 2 신호 95% 각 프로브에 대한 핵의 -99 %에 득점했다. 그림 1은 염색체 5 ~ 9의 짧은 팔 사이에 상호 translocation을위한 준비에서 metaphase 및 계면 핵을 보여줍니다.

배아 blastomeres에서 계면 핵으로 신호는 밝고 이산하고 사용되는 색상에 대한 별도의 밴드 패스 필터를 사용 득점해야합니다. 그림 2는 염색체 5 9 정상 또는 균형 염색체 보완과 일치 정상적인 신호 패턴 (테스트의 모든 loci 2 부), 그리고 translocation의 불균형 제품과 함께 일관성있는 비정상적인 신호 패턴과 함께 핵을 가진 blastomere 핵을 보여줍니다 그 염색체 5 염색체 9​​ translocated 세그먼트에 대한 trisomy (3 부)의 translocated 세그먼트에 대한 monosomy (한 사본)을하고 있습니다.

그림 1
그림 1 metaphase 확산과 짧은 염색체 5 무기와 5p14.3과 9p24.1에 중단점 9 사이의 상호 translocation의 이동 통신사에서 교양 말초 혈액 lymphocytes에서 준비 계면 핵 :. 46, XY는, T (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) 봐야죠 t (5; 9) (5ptel48 -, 9ptel30 +; 9ptel30 -, 5ptel48 +, 9cen +). 생선 프로브는 모두 translocated 세그먼트에 대한 선정 (5p14.3 → 5pter, 빨강 Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, 녹색 Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC)와 염색체 9​​ 중심의 세그먼트 (9p24.1 → 9qter, 푸른 애보트 CEP 9 알파 위성 SpectrumAqua).

그림 2
일 - 3 배아에서 계면 blastomere의 핵 그림 2. 신호는 각 fluorochrome와 합성 이미지를 형성 합병에 다른 필터를 사용하여 캡처. (A) translocation 염색체의 정상 또는 균형 보완과 일치 각 로커스, 두 개의 복사본을 나타내는 각 프로브에 대한 두 신호. (B) 하나의 빨간색 신호 세 녹색 신호와 염색체 5 translocated 세그먼트의 복사본 하나, 인접과 일치 염색체 9​​ translocated 세그먼트의 세 사본과 염색체 9​​의 중심 세그먼트의 두 복사본을 나타내는 두 청색 신호 9p24.1 → 9pter에 대한 5p14.3 → 5pter 및 trisomy에 대한 monosomy과 불균형 제품에 발생하는 translocation -1 분리.

토론

하나의 배아 세포 (blastomere)에 원위치 하이브리드화 (물고기)의 형광의 응용 프로그램 practicalities 및 신호 패턴의 해석에 모두 특별한 도전을 선물한다. biopsied 세포는 현지화 다음 물고기를 촉진하기 위해 슬라이드에 사전 정의된 영역 내에서 전파해야, 극단적인 치료는 세포는 세포질이 분산되었다는, lysed입니다 확보에 주의할 필요하고, 그 핵 진단이 단일 셀, 엄격한 채점과 해석 지침이 적용되어야의 결과에 따라로서, 그리고, 보이는 그대로입니다. 그러나, 경험 손으로, 물고기는 임상 연습에 미리 주입 유전자 진단 (PGD)를위한 강력한 기법입니다. 물고기에 의해 PGD의 원리는 다른 fluorochromes 또는 haptens으로 표시 대상 특정 DNA 프로브는 특정 loci의 사본 번호를 검색하는 데 사용할 수있는 것이 있으며, 따라서 Robertsonian 포함한 염색체 rearrangements의 meiotic 분리 (1)과 관련된 염색체 불균형을 감지하는 translocations, 상호 translocations, 뒤집어, 복잡한 rearrangements (2). 생선도 더 돌연변이 특정 시험 (3, 4)가없는있는, X - 연결된 질환으로 가정에서 여성의 배아를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 더 controversially, 생선도 도움을 재생산 (5, 6)의 효율성을 시도하고 개선하기 위해 산발적 염색체 aneuploidy을위한 화면으로 사용되었습니다 있지만, FSIH를 사용하여이 테스트의 예측 가치에 unacceptably 낮은 될 가능성이 높습니다 대부분의 사람들이 손과 그것은 일상적인 임상 사용 (7)하지 않는 것이 좋습니다. 이 문서는 임상 단일 세포 진단에 적용 물고기의 기술적 측면과 한계에 중점을두고 있습니다.

단일 blastomeres을 전파하고 고칠 수있는 방법은 메탄올 / 초산 (5, 8), 트윈 / HCL (9), 그리고 트윈 / HCL과 메탄올 / 초산 (10)의 조합을 포함합니다. 유사 이전에 고정 후 및 / 또는 펩신과 paraformaldehyde 치료 확산에 셀 hypotonic 치료를 포함합니다. 방법을 적절히 실험실 (14)에 대한 검증해야합니다. 트윈 / HCL 방법은이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 트윈 / HCL 방법은 다른 실험실에서 기술적으로 단순하고 고도로 재현할 수 있습니다. 이 방법은 허용 진단 정확도 (7) 섹스 결정 및 염색체 rearrangements의 생선 진단을위한 단일 핵을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

프로브의 혼합은 다른 제조 업체의 프로브와 프로브를 직접 표시하고 간접적으로 표시 결합할 수 있습니다. 생식 파트너 모두에서 사전에 테스트하여 PGD에 대한 구체적이고 적합으로 표시하는 경우 사용할 수 있지만 알려진 다형성 염색체 영역에 대한 프로브 (11, 12), 또는 다른 염색체 (13)와 함께 상당히 상호 잡종으로 알려진 사람은 피해야한다 . 차별 프로브를 사용할 수 fluorochromes / haptens과 전략은 다음과 같습니다 텍사스 레드 (TR), 플루오레신 isothiocyanate (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, TR - 아비딘로 검색 biotinylated 프로브, FITC - 아비딘, 또는 싸이 - 5 streptavidin (FarRed 필터를 사용하여 시각), 노란색 신호, 하이브 리다이 제이션의 두 번째 라운드와) TexasRed과 SpectrumGold 필터를 사용 SpectrumOrange의 연속 캡처 만든 삼분의 일 색상을 생성하는 적색과 녹색의 프로브를 섞는다.

X와 Y 염색체와 autosome 하나의 centromere 지역에 대한 구체적인 세 프로브를 포함하는 프로브 세트, 성별 결정 (14)을 권장하며 autosomal 프로브 (2N, 47 trisomy X를 구분하는 ploidy함으로써 구축하는 데 사용됩니다 , XXX)와 triploidy (3n, 69, XXX), 그리고 tetrasomy X (48, XXXX)과 tetraploidy (4N, 92, XXXX) 사이. 이 프로브 설정은 매우 낮은 다형성 비율을 가지고 시연되었으며, 따라서 전처리 작업 - 최대 생식 파트너, 전형적인 프로브는 알파 - 위성 X, Y, 18을 포함하고있는 애보트 AneuVysion 믹스는이 설정을 적용으로 설정 (14) 필요하지 않습니다.

특정 다시 정리하기위한 프로브 혼합합니다 이상적으로 염색체 불균형으로 다시 정리하기의 모든 예상 제품을 감지하는 적어도 충분한 프로브를 포함하고 있습니다. 이것이 불가 능할 경우, 프로브는 들키지 불균형 제품이 인식 임신이 아닌 실용적으로 평가하고 매우 낮은 유행이 (14) 허용 수 있습니다 가질 가능성이 어디에 있었는지 혼합. 모두 생식 파트너 교양 림프구 metaphases에서 테스트한다. 적어도 열 metaphase 확산은 프로브과 같이 다시 정리하기의 다른 세그먼트에 예상을 잡종 수 있도록 프로브 특이성, polymorphisms 및 교차 하이브 리다이 제이션에 대한 검사, 그리고 염색체 다시 정리하기 캐리어 위해해야​​합니다. 또한, 이러한 준비에서 최소한 100 계면 핵은 신호 특이성, 밝기, 그리고 discreteness (14)을 평가하기 위해 득점해야합니다.

Commercial PGS 프로브 세트 사용할 수 있습니다 (예 : 애보트 MultiVysion PB 또는 PGT), 자주 개념의 제품 aneuploid 수있는 염색체를 대상으로하고, 대상 염색체 당 하나의 프로브로 구성된. 일반적으로 핵은 염색체 13, 15, 16, 18, 21, 22, 그리고 XY (14)에 대한 분석을 제공하는 추가적인 염색체를위한 탐사선과 두 번째 하이브리드화가있을 수 있습니다. 확산 및 생선 기술은 여기에 설명된를 사용하여이 테스트의 예측 가치는 대부분의 사람의 손에 unacceptably 낮은 가능성이 높습니다 그리고 그것은 일상적인 임상 사용 (7, 15)을 위해 사용하지 않는 것이 좋습니다.

이러한 단일 세포에 적용 비교 게놈의 하이브 리다이 제이션 (CGH)로 기술 (2001. 윌턴 외) 모든 염색체의 사본 번호를 테스트 할 수 있으며, 단일 염기 polymorphisms의 사용 (SNP)는 배열과 정량 분석 (웰스 외 . 2008) 또는 "karyomapping"genotyping은 (핸디 외. 2009) 염색체 aneuploidy을 감지하는 대안 기법을 약속하고 있습니다. 그러나, 세그먼트 불균형에 대한 해결 한도와 정확도가 불확 실한 남아 그것은 물고기가 작은 세그먼트를 포함하는 염색체 rearrangements을위한 최고의 기술로 지속 가능성이 높습니다.

공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염산, 2.5LVWR international101254H
염화 나트륨, 5kgVWR international443827W
염화칼륨, 250gVWR international26764.232
무수 인산수소이나트륨, 500gVWR international102494C
제일인산칼륨, 500gVWR international10203 4B
수산화나트륨 펠릿, 500gVWR international28245.265
Tween20, 500mLVWR international663684B
에탄올, 2.5LVWR international8.18760.2500관세 지급 완료
구연산삼나트륨, 5KgVWR international27833.363
카우검, 250mLCow Proofings Ltd.더 이상 제공되지 않음오래된 재고는 여전히 미술 도구점에서 찾을 수 있습니다.
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500μLCytocell Ltd.DES500L150μ바이알 회수’각 Cytocell TEL Probe와 함께 제공됨
네일 바니시, 12mL부츠10088316001
아민 코팅 슬라이드, 25매GenetixK2615
DAPI, 0.1mLSigma-AldrichD-9542
Vectashield, 10mLVector LaboratoriesH1000
Texas-Red-avidin, 0.001mLVector LaboratoriesA-2016
FITC-아비딘, 0.001mLVector LaboratoriesA-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mLGE HealthcarePA45001
마이크로 원심분리 튜브, 1.75mL, 500개입Thistle ScientificAX-MCT-175-C
마이크로원심분리관, 0.6mL, 1000개입 박스Thistle ScientificAX-MCT-060-C-CS
30ml 범용 용기, 400개입/박스스테릴린(Sterilin)128BNHS Supply Chain에서 구입 가능, 카탈로그 번호 KCP053
핫 블록
알코올 램프 알코올 램프 소켓 알코올 램프 심지VWR international451-0107 451-3112 451-3111
마개 달린 유리 피펫Fisher ScientificPMK-300-052R
해부 현미경Wild Heerbrugg
티슈, 100박스NHS 공급망MJT058
금속 배양 트레이
플라스틱 멜라민 트레이VWR international682-009
오븐
마우스 피펫 마우스피스Scientific Laboratory Supplies LTDHAE3700
튜브
시린지 필터, 0.2$\mu$mμm 공극 크기, 직경 25mmFisher ScientificFDM-340-010U
다이아몬드 펜VWR international818-0021
슬라이드용 핫 블록Thermo Fisher Scientific, Inc.HBOSBB
하이브리드화 챔버
조직 롤NHS 공급망MJT004
슐리퍼데커 자(Schieferdecker Jar)VWR international631-9313
코플린 자(Coplin Jar)VWR international631-9331
미세 핀셋VWR international232-2123
둔단 핀셋VWR international232-2113
1000mL 비커VWR international213-1642
위상차 현미경Nikon InstrumentsE200
섬유 제거 블로팅 카드, 100매입Fisher ScientificSDE1
청색 프로스트 현미경 슬라이드, 100매입Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3022
커버슬립, 18x18mm, No. 1, 200개입 박스Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3110
커버스립, 22x22mm, No. 0, 200개입Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3104
커버슬립, 22x50mm, No. 0, 100매입Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3206
1mL 주사기, 100개입 한 박스NHS 공급망FWC045
1mL 피펫 팁, 1000개입 10랙Thistle ScientificAX-T-1000-C-L-R
배양기LEEC
항온수조연구비 지원 장비W22
알코올 온도계이용 가능한 다양한 소스
pH 측정기Jenway3305
pH 전극VWR international662-1759Jenway pH 미터 3305용 BNC 플러그
가열 교반기비비(Bibby)HC502
1mL 파스퇴르 피펫, 500개입/박스Scientific Laboratory Supplies LTDPIP4202
Parafilm, 50mm x 75mVWR international291-1214

참고문헌

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