이 문서는 부정적인 얼룩의 전자 현미경을 (EM)을 사용하여 생물 학적 macromolecules의 3 차원 (3D) 재건을하는 표준 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 임의의 원뿔 기울기 재건 방법 (RCT)을 사용하여 중간 해상도 Saccharomyces cerevisiae의 exosome의 복합의 3D 구조를 얻는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 입자 전자 현미경 (EM)이 재건 최근 대형 macromolecular의 단지의 3 차원 (3D) 구조를 얻을 수있는 인기있는 도구가되었습니다. X - 선 crystallography에 비해 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 단일 입자 EM 재건 특히 대형 macromolecular의 단지에 대해, X - 레이 crystallography에 병목있는 단백질 샘플을 구체화 필요가 없습니다. 둘째, 그것은 단백질 샘플을 다량 필요하지 않습니다. 결정에 필요한 단백질의 밀리그램에 비해, 단일 입자 EM 재건은 부정적인 얼룩 EM 방법을 사용하여 나노 어금니 농도에서 단백질 솔루션의 몇 마이크로 리터 필요합니다. 그러나, 높은 대칭과 함께 몇 macromolecular 어셈블리에도 불구하고, 하나의 입자는 EM은 특히 이러한 대칭없이 많은 표본에 대한 (하단보다 1 나노미터 해상도) 상대적으로 낮은 해상도로 제한됩니다. 이 방법도 연구에서 분자의 크기에 의해 제한, 일반적으로 냉동 수산화 표본에 대한 부정적인 스테인드 표본 300 KDA에 대한 즉, 100 KDA.
알 수없는 구조의 새로운 샘플의 경우, 우리는 일반적으로 부정적인 얼룩으로 분자를 포함하는 중금속 솔루션을 사용합니다. 표본은 다음 분자의 2 차원 (2D) micrographs을 위해 전송 전자 현미경으로 검사합니다. 이상적으로, 단백질 분자가 단일 차원 구조를 가지고 있지만 micrographs 다른 방향을 나타냅니다. 이러한 micrographs은 "단일 입자"로 디지털 및 컴퓨터에서 처리됩니다. 2 차원 배열과 분류 기법을 사용하여 같은 전망에 균일한 분자는 클래스로 클러스터된 수 있습니다. 그들의 평균 분자의 2 차원 형태의 신호를 향상시킬 수 있습니다. 우리가 적절한 상호 표정 (오일러 각도)와 입자를 지정 후, 우리는 3 차원 가상 볼륨에 2D 입자 이미지를 재구 성할 수있게 될 것입니다.
단일 입자 3 차원 재건에 필수적인 단계가 제대로 각 단일 입자의 적절한 방향을 지정하는 것입니다. 각도 reconstitution 1 임의의 원뿔 기울기 (RCT) 방법 2를 포함하여, 각 입자에 대한보기를 할당하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 부정적인 얼룩 EM와 RCT를 사용하여 효모 exosome 복합 3D 재건을 얻는 우리의 연습을 설명합니다. 이것은 전자 현미경 및 이미지 프로세싱 우리의 프로토콜 RCT의 기본 원칙을 다음 있지만 방법을 수행할 수있는 유일한 방법은 아니라는 것을 주목하여야한다. 우리가 먼저 지속적인 얇은 탄소 필름 층으로 덮여 홀리 탄소 격자를 사용하여 단백질의 크기에 비해 두께 Uranyl - 편대의 계층에 단백질 샘플을 포함하는 방법에 대해 설명합니다. 그러면 표본을 수집 전송 전자 현미경에 삽입 untilted (0 급) 및 처리와 효모 exosome의 초기 3D 모델을 얻기 위해 나중에 사용됩니다 micrographs의 기울어진 (55 급) 쌍. 이를 위해, 우리는 RCT을 수행하고 다음 상세 검색 방법 3 일치 투영을 사용하여 초기 3D 모델을 수정하십시오.
프로토콜
1. 랜덤 코니컬 틸트 방법의 원리
- 임의의 원뿔 틸트 방식의 원리는 전자 현미경 내부의 표본 같은 지역의 micrographs 한 쌍을 데리고가 필요합니다. 한 사진은 untilted 위치 (그림 1A)의 시편을 찍은이고 다른 사진은 50-70도 (우리의 경우에, 우리는 55도 사용) 사이의 각도로 기울어져 시편을 찍은 것입니다. (그림 1B)
- 선택된 컴퓨터를 사용하여 디지털 현미경 쌍 같은 입자의 측면과 이미지의 측면을 넣어 것입니다. (그림 1C)
- 입체 좌표에서 untilted 입자와 그 기울어져 파트너의 이미지는 틸트 축과 기울기 각도의 방향으로 서로 상호 있습니다. (그림 1D)
- untilted 입자 이미지 정렬 해당 azimuthal 위치에 기울어져 입자의 이미지를 제공합니다. (그림 1E)
- azimuthal 공간을 채우는 기울어져 입자의 여러 이미지를 사용하여 분자의 3 차원 구조는 다시 - 투영 알고리즘을 사용하여 복원하실 수 있습니다. (그림 1 층)
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토론
이 문서에서 우리는 샘플 준비 상세한 프로토콜과 부정적인 얼룩의 전자 현미경을 사용하여 exosome 복잡한 세 차원 재건을 제시. 이 방법을 사용하여, 우리는 구조의 어떤 사전 지식없이 임의의 원뿔 기울기 방법을 사용하여 3D 재건을 획득하였습니다. 랜덤 원뿔 틸트 방식은 반드시 단일 샘플을 필요로하지 않습니다 그러나 다음과 같은 투영 일치 상세 검색 단계는 높은 해상도를 달성하기 위해서는 단일 표본이 필요합니다.
부정 얼룩 샘플, 얼룩 두께가 작동하기 위해 임의의 원뿔 기울기 방법에 대해서는 매우 중요합니다. 너무 얇은 얼룩이 재건의 유물을 소개하는 높은 기울기 각도에서 분자의 검은 헤일로가 발생합니다. 너무 두꺼운 얼룩은 현미경으로 입자의 신호 대 잡음 비율을 줄일 수 있습니다. 우리가 사용하는 지속적인 탄소 필름의 얇은 층이 적용 홀리 탄소 격자보다 쉽게 최적의 얼룩 조건을 달성 도움이 될 수 있습니다. 집에서 만든 홀리 탄소 그러한 Quantifoil 또는 C -.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 전체 프로토콜을 확립하기 위해 도움 예일 대학에서 초기 프로토콜과 왕 실험실의 구성원 확립 도움 UC 버클리에서 노갈레즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 지원에 대한 의학의 예일 학교 cryo - EM 시설 및 고성능 계산 센터에서 직원을 인정합니다. HW는 스미스 가족 Awardee입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 폴리비닐 포름알데히드 수지(Polyvinyl Formal Resin) | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| 우라닐 포르메이트(Uranyl Formate) | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 mesh 일반 그리드 | SPI Supplies | 3040C | |
| Carbon coater Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 전자현미경 | FEI | ||
| 글로우 방전 장치(Glow Discharger) | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
참고문헌
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles fr....
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