공명과 자연 래맨 Microspectroscopy에 형광 배경 거부

요약

우리는 형광 신호에서 래맨 격리 ultrafast 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전 유지에 관한 능력을 활용 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다.

초록

래맨 분광법은 종종 특히 생물 학적 샘플, 강한 형광 배경에 의해 퍼진. 샘플이 ultrafast 펄스, temporally timescale은 분리 수 picosecond에 신호를 중복 spectrally 분리 수있는 시스템의 기차와 흥분되면 즉시 늦게 도착 형광 빛으로부터 래맨 흩어져 빛을 도착. 여기 래맨과 형광 신호를 분리하기 위해 저전력 광 커 게이트의 형태로 모든 광학 스위​​칭을 사용하는 복잡한 비선형 광학 시스템의 건설과 운영을 논의. 평균 전력 80 MHz의 반복 속도의 2.4 W와 함께 하나의 808 nm의 레이저는 래맨 비산들을 흥분시키기 위해 샘플로 전송 404 nm의 라이트의 <5 MW로 변환되는 808의 NM 라이트의 약 200 MW로, 분할이다. 나머지 변하지 않은 80​​8의 NM 라이트는 다음의 모든 광학 셔터를위한 펌프 역할을 비선형 매체로 전송됩니다. 셔터가 약 5 %의 피크 효율 800 FS의를 열고 닫습니다. 이 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 펄스 에너지와 생물학적으로 안전하게 유지 평균 파워를 사용하여 80 MHz의 반복 속도 래맨 및 형광 신호를 분리 수 있습니다. 시스템이 광학 전력 측면에 여분의 용량이 없기 때문에, 우리는 몇 가지 세부 설계 및 정렬 고려하는 시스템의 처리량을 극대화에 도움. 우리는 또한 커 매체 내의 신호 및 펌프 빔의 공간적 시간적 및 중복뿐만 아니라 스펙트럼 획득을위한 상세한 프로토콜을 얻기위한 프로토콜을 논의합니다. 마지막으로, 우리는 시간 게이팅 시스템을 사용 강한 형광의 존재에서 얻은 래맨 스펙트럼의 몇 가지 대표적인 결과를보고합니다.

프로토콜

1. 일부 보험이 시스템 내의 래맨 샘플을 준비하고 배치에서 찍은해야합니다.

1. 시스템이 일반적으로 매우 짧은 작업 거리와 함께 매우 높은 수치 조리개 목표를 이용하게하기 때문에 샘플은 coverslip에 표시됩니다. 생물 학적 시료는 일반적으로 Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)에 탑재된 제 1 두께 coverslip에 표시됩니다.
2. 특히 액체 샘플, 인간에게 유독 사람은 실리콘 에폭시를 통해 개방에 초경 coverslip있는 작은 유리병에 배치됩니다. 병 그 다음 측정을 위해 거꾸로 수 있습니다.
3. Google 시스템은 펌프 및 신호 펄스의 정확한 타이밍에 의존하기 때문에, 우리는 목표를 위아래로 번역 우리 현미경의 종래의 초점 조정을 사용하지 않기로 제약합니다. 이것은 추가 및 시스템에서 광 경로를 차감됩니다. 대신, 우리는 자체의 독립적인 포커스를 제어 현미경 스테이지 위에 장착 보조 무대에서 우리의 샘플을 넣으십시오.

2. 시간 문이 래맨 스펙트럼을 이용하려면, 여기 빔 제대로 준비를해야합니다.

1. Sapph 레이저 (카멜레온, 일관된 시스템, 산타 클라라, CA) : 우리는 빛이 2.4 W 조정할 펄스 티의 새로운 시작. 80 MHz의 펄스 열차의 각 펄스 에너지의 30 NJ가 140 FS의 시간적 너비를 가지고 있으며, ~ 6 NM의 스펙트럼 대역폭과 808 nm의 중심 스펙트럼 있습니다.
2. 레이저 캐비티를 다시 입력으로부터 - 반사를 방지하기 위해 조명은 패러데이 아이 솔 레이터를 통해 전달됩니다. 패러데이 아이 솔 레이터 앞에 배치 반 파장 판은 시스템에 보낸 총 전력의 지속적인 튜닝을 수 있습니다.
3. 6 NM 가장 래맨 모드를 해결하기 위해 너무 광범위 대역폭이기 때문에, 빔은 808 nm의 중심은 매우 좁은 (0.8 nm의 FWHM, 앤도버 공사, 살렘, NH) 대역 통과 필터를 통해 전송됩니다.
4. 빛이 후 결정이 (CASIX, 복주, 복건, PR 중국) 808의 nm의 404 nm의로의 파장을 절반으로 5mm β - 바리움 Borate (BBO)에 비염 색 성의 이중어 (F = 100mm)에 의해 초점을 맞추고 있습니다. BBO 크리스탈은 팁 및 틸트 컨트롤 마운트에 배치하고, 또한 번역 무대에서 마운트됩니다. 파장 변환의 효율성을 최대화하기 위해, 결정은 이중어의 초점에 대해 정확하게 대칭 배치하고, 그 결정 축은 들어오는 광선의 편광에 정렬과 함께해야합니다.
5. 파장 변환 효율은 편광에 의존하기 때문에, 샘플로 보내 빛의 양을 제어할는 패러데이 아이 솔 레이터 후 하반기 - 웨이브 플레이트를 삽입하여 얻을 수 있습니다. 이 waveplate 회전하여 샘플로 보내 빛의 강도는 독립적으로 펌프 빔 (아래에 설명되어 수)에 보낸 강도 조정할 수 있습니다.
6. 파장 - 변환 빛이 종료 광선이 현미경의 목표의 뒤에 조리개를 채울 정도로 크고, 그리고 거꾸로 현미경 (IX - 71, 올림푸스로 이동합니다 그러한 선택한 두 번째 비염 색 성의 이중어 (F = 500mm)에 의해 recollimated입니다 이 스티어링 거울을 통해 센터 밸리, PA).
7. 시스템의 가장 단일 구성 요소 내에 위치해 광학 요소되고있는 현미경의 목표는, 광학 축을 정의합니다. 이 축에 여기 빔을 정렬하려면 미러는 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. CCD 카메라 시대 (μEye, IDS, Obersulm, 독일) 현미경의 영상 포트에 연결된에서 백 반영 레이저 광선을 관찰하면서 두 조향 미러는 다음 반복 조정됩니다. 카메라에있는 이미지가 현미경의 필드의 전망을 중심으로 중이라고 가정할 때, 광선의 초점 자리가 Z - 축을 따라 목표의 현미경 칩 및 번역 중심에서 축 중심 지점을 변경하지 않는 것입니다 defocused 빔니다.
8. 샘플은 샘플 비행기에 배치하고 함께 조사하면 레이저 광 래맨 산란이 발생합니다. 현미경 목표 아래 배치 이색성 필터는 현미경의 측면 포트에 래맨 흩어져 빛을 연출, 여기 빔의 파장 - 이동 래맨 흩어져 빛을 (및 형광) 분리. 현미경은 신호 빛이 collimated 현미경에서 나온다 그러한이 경로 내의 모든 렌즈를 제거 바뀌었습니다.
9. 현미경에서 새로운 신호 빔은 글랜 - 톰슨 polarizers의 명확한 구경보다 큰이기 때문에, 0.47x 망원경은 광선을 축소하는 데 사용되는 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 75mm, F2 = 35mm)의 건설.
10. 신호 표시등은 다음 실험실 프레임에 수직과 관련하여 0 °에서 지향 글랜 - 톰슨 편광으로 편광, 그리고 그것이 펌프 빔과 recombined하는 이색성 거울로 이동합니다.

3. 피크 효율에서 작동하는 광 게이트 위해서,주의뿐만 아니라 펌프 빔 (커 빔)의 준비에 촬영해야합니다.

1. 펌프 펄스 먼저 신호 빔의 최종 크기를 일치 두 비염 색 성의 doublets (F1 = 35mm, F2 = 100 ㎜)과 건설 망원경으로 0.35x로 확대됩니다.
2. 펌프 빔은 다음 펌프 및 신호 펄스 (아래에 설명되어 수 조정)의 시간적 중복을 보장하기 위해 조정할 수 있습니다 선형 변환 스테이지에 배치 직각 프리즘으로 구성된 지연 라인으로 전송됩니다.
3. 지연 선 후, 빔은 실험실 프레임에 수직에 대하여 45 °의 지향 반 파장 판과 편광을 통해 전송됩니다. 그것은 비선형 매체에 도달하면 이것은 펌프 빔의 적절한 편광 상태를 보장합니다.
4. 빛이 후 잘게 펌프 빔의 위치를​​ 조정하는 데 사용되는 두 스티어링 거울, 압전 컨트롤과 함께 하나의에서 반영 같은 신호 빔과 공간이 중복되는. 중복은 두 위치 한 닫고 ​​대들보가 결합되어 이색성 거울에서 멀리 떨어진 하나 펌프 및 신호 광선을 관찰함으로써 얻어진다. 가까운 지점과 멀리 지점에서 빔을 오버랩하는 압전 미러에 두 개의 대들보를 중복을 가장 먼저 조향 미러를 사용하여 펌프 빔은 신호 빔을 정확히 collinear을 만들 수 있습니다.
5. 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다.

4. 두 대들보가 결합으로 커 게이트 및 수집 시스템은 수집된 시간 문이 신호를 최대화하기 위해 설정됩니다.

1. 펌프 및 신호 빔을 먼저 비선형 매체 내의 흥미로운 래맨 산란에서 잔여 여기 조명을 방지하기 위해 404 nm의 6의 OD를 가진 이색성 필터를 통해 전달됩니다.
2. 펌프 및 신호 들보는 모두 비선형 물질을 포함하는 1cm의 pathlength 석영 쿠베트에 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 다음 있습니다. 적당히 높은 비선형 인덱스 (CS _2보다 높은), 그리고 적당히 짧은 시간적 응답 (<2 PS)하는 데 모든 비선형 자료는 여기를 이용하실 수 있습니다. 이 실험을 위해, 우리는 비선형 인덱스 N ₂ = 3.1 × 10 ^-18 m ² / W.을 가지고 이황화 탄소, CS ₂ 사용 빛이 그런 다음 첫 번째와 동일 초점 거리와 두 번째 쌍으로 된 것으로 recollimated 있습니다.
3. 광선은 다음 808 nm의 10의 OD를 결합하여 그 흡수와 간섭 필터의 집합을 통해 다음 통과 및 회전 마운트에 글랜 - 톰슨 분석기, 그리고 수 있습니다.
4. 마지막으로, 신호 조명은 섬유가 X, Y, 그리고 Z '의 번역을 허용하는 단계에 마운트되어 50 μm의 다중 모드 광섬유로 비염 색 성의 이중어 (F = 35mm)의 초점을 맞추고 있습니다 섬유는 다음 첨부 CCD 카메라 (SP2300i 각각 Pixis 100B, 프린스턴 인 스트 루먼트, 트렌 튼에서 제조한 모두, NJ)과 상업 영상 분광기로 결합됩니다.
5. 수집된 신호를 최대화하기 위해 수집 시스템을 정렬하려면 분석기은 0으로 설정됩니다 °과 톨루엔의 테스트 샘플은 샘플 비행기에 배치됩니다. X, Y, 그리고 섬유 마운트의 Z 컨트롤을 조정하여, 수집된 래맨 신호가 최적화되어 있습니다.
6. 펌프 및 신호 빔의 적절한 공간과 시간적 중복을 보장하기 위해, 거울은 현미경의 샘플 비행기에 배치됩니다. 404 NM 필터는 시스템에서 제거됩니다. 분석기는 90 ° 회전 retroreflected 404 NM 빔 그것은 카메라를 포​​화하지 않는 등 조정 강도와 분광기로 전송됩니다. 에서 펌프 빔과 함께, 분석기는 전송된 404 nm의 신호를 최소화하기 위해 회전합니다. 펌프 빔 다시 켜져있는 404 나노미터 빛의 전송이 증가하기 시작 때까지 지연 단계는 천천히 조정합니다. 그런 다음, 반복하여 지연 무대, 압전 미러를 조정하고, X, Y, 그리고 Z 섬유의 컨트롤은, 하나는 신호를 극대화할 수 있습니다.
7. 404 NM 빔과 래맨 흩어져 빛을 시스템을 통해 약간 다른 경로를 걸릴 수 있습니다 역전사이 반영되기 때문에 최종 조정은을 변경하여 샘플 단계와 약간 조정 정렬에 강한 래맨 scatterer (예 : 톨루엔 등) 배치에 의해 만들어진 지연 무대, piezeo - 전기 거울, 그리고 섬유의 X, Y, 그리고 Z 컨트롤은 래맨 신호를 최적화할 수 있습니다.

5. 한 시간 문이 래맨 스펙트럼의 컬렉션은 몇 가지 스펙트럼의 취득 시스템 아티팩트에 대한 해결하기 위해 필요합니다.

1. 분석기가 0 °에 여기 빔과 해제 펌프 빔 설정을 통해 "ungated"스펙트럼은 시간 게이팅 시스템의 혜택없이 취득 될 스펙트럼을 나타내는, 촬영입니다.
2. 분석기는 90 °, 여기 빔과 펌프 빔 아직 해제로 설정으로 다시 지상 스펙트럼은 시스템에서 polarizers 및 기타 요소를 통해 유출 길잃은 빛의 양을 나타내는, 촬영입니다.
3. 와 함께 90에서 남은 분석기 °그리고 모든 광선, "문이"스펙트럼이 펌프 빔의 존재에 의해 넘어 polarizers을 통해 허용 래맨 흩어져 빛을 대표, 촬영입니다.
4. 마지막으로, 아직 90 °에서 분석기로, 여기 빔 해제 및 펌프 빔은 두 번째 백그라운드 스펙트럼은 분광기를 입력 808의 NM 라이트의 잔여 금액의 "문이"스펙트럼에 기여 대표, 촬영입니다.
5. 또한, 스펙트럼은 카메라와 전자 제품의 기준 "어둠"의 신호 레벨을 특성화,에서 모든 레이저와 함께 이루어집니다.
6. 일반적인 문제를 몇 분 걸쳐 통해 데이터를 수집하면 - 스펙트럼 종종 긴 통합 시간을 필요로하기 때문에, 그것은 우주 광선의 적절한 교정 수 있도록 여러 조각 (프레임)에 해당 통합 시간을 깰 필수적입니다.

6. 일단 인수, 여러 처리 단계는 데이터의 품질과 외관을 개선하기 위해 도움이됩니다.

1. 첫째, 모든 스펙트럼은 어둡 "어둠"의 스펙트럼을 빼서에 의해 수정됩니다.
2. 우주 광선에 대한 해결하려면 하나의 인수를 구성 여러 개의 프레임은 픽셀별로 픽셀 단위로 서로 비교됩니다. 모든 프레임에 걸쳐 해당 픽셀에 대한 평균 값에서 2 중간 편차 이외의 떨어지는 모든 프레임의 모든 픽셀에 대한, 그 픽셀의 가치는 모든 프레임에 걸쳐 평균 값으로 대체됩니다.
3. 우주 레이 수정된 프레임은 다음 평균 및 Savitzky - 골레이 필터 ¹ smoothed 있습니다.
4. "진정한"문이 스펙트럼을 추출하려면, 우리는 측정 문이 스펙트럼에서 "펌프 전용"스펙트럼 "여기 전용"을 빼야합니다.
5. 마지막으로, 문이 및 ungated 스펙트럼 다음 리버와 Mahadevan - 얀센 ^2의 방법을 사용하여 결정 5 ^일 주문 다항식을 빼서하여 정정 배경입니다.

7. 대표 결과 :

그림 1. 커 게이팅 시스템의 개략도 다이어그램. SHG 경로가 파란색으로 표시되는 동안 펌프 빔 경로가 빨간색으로 표시됩니다. 형광이 temporally 필터링되었습니다 경로가 노란색으로 표시되는 동안 래맨와 형광이 overlapped되는 경로는 녹색으로 표시됩니다. 다음과 같은 약어 : BPF, 밴드 패스 필터, CCD, 전하 결합 소자, DCM, 이색성 거울, FI, 패러데이 아이 솔 레이터, λ / 2, 반 파 판, LPF, 긴 패스 필터, NLM, 비선형 매체, P, 편광 ; SHG 두번째 고조파 세대 크리스탈.

그림 2 위로 :. 침지 기름에 용해 coumarin의 원시 스펙트럼. 빨간색 곡선 (분석기는 최대 전송 설정) 오픈 개최되는 게이트와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블랙 곡선 최소 전송 및 펌프 빔 적용 (문이 스펙트럼)에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 스펙트럼을 보여줍니다. 블루 곡선 최소 전송없이 펌프 빔 적용에 대한 정렬 분석기와 함께 찍은 spectum (게이트 폐쇄 개최)를 보여줍니다. 그린 곡선은 펌프 빔이 적용된 취한 스펙트럼을 보여줍니다. 점선 마젠타 라인은 아래 패널에 표시되는 스펙트럼 영역을 나타냅니다. 모든 검사 결과는 11 점, 3 순서대로 Savitzky - 골레이 필터 smoothed되었습니다. 하단 : 형광 배경 제거 후 침지 기름에 용해 coumarin의 스펙트럼. 레드 곡선은 게이트와 스펙트럼이 열려 개최하고, 파란색 곡선은 문이 스펙트럼이다. 문이 스펙트럼은 명확 오일의 뒤얽힌 높은 wavenumber 피크 특성을 보여줍니다.

토론

의생명 래맨 ​​분광법의 분야는 생물 학적 진단에 몇 가지 어려운 문제를 해결에 대한 입증 가능성의 결과로 지난 몇 년간 증가하고 관심을 보여줬습니다. 예를 들어, 래맨 스펙트럼은 암 탐지 ^{3, 4, 5, 6에서} 진단 가치를 가지고 표시되었습니다. 래맨 분광법은 세균 quantitation ^{7, 8} 및 세균성 약물 반응 ^9도 사용되고 있습니다. 그것은 또한 뼈 건강에서 ¹⁰ biofluid 분석 ^{11, 12에} 이르기까지 다른 생명 의학 어플 리케이션의 광범위한 응용 프로그램을 발견했습니다.

는 매우 약한 단면 같은 잠재력에도 불구하고, 그러나, 래맨 분광법은 대부분의 생물 학적 시스템에서여 - 이리에 큰 장벽을하고 있습니다. 따라서, 래맨 신호를 쉽게도 매우 겸손한 형광 배경에 압도 수 있습니다. 많은 기술은 형광 lineshape ^{2, 13, 14} 제거 존재...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
렌즈	ThorLabs	여러	1퍼센트 각각의 최대 전송 손실을 가지고 올 코팅 렌즈
조정할 수있는 티 : Sapph 레이저	응집 성의	카멜레온	30 NJ, 200 FS, 80 MHz의
40X 기름 침지 목표	올림푸스	UApo/340	NA = 1.35
거꾸로 현미경	올림푸스	IX - 71	측면 포트의 모든 렌즈를 제거하기 위해 수정
하프 웨이브 플레이트	Thorlabs	AHWP05M - 600
글랜 - 톰슨 편광자	Thorlabs	GTH10M	~ 10 %의 전송 손실
분광계	PI 액튼	SP2300i
CCD	PI 액튼	Pixis 100B
Mathmatical 소프트웨어	MathWorks	MATLAB	버전 2008a
패러데이 아이 솔 레이터	EOT	BB8 - 5I
압전 거울	뉴 포트	AG - M100
BBO 결정	CASIX	사용자 정의	1mm 두께
대역 통과 필터 1	앤도버	008FC14	808 ± 0.4 nm의
이색성 거울	Semrock	FF662 - FDI01	662 NM에서 대역 에지
롱 - 패스 필터	Semrock	BLP01 - 405R	417 NM에서 대역 에지
대역 통과 필터 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 NM
CS 2	시그마 - 알드리치	335266	99 % 순도
Coumarin 30	시그마 - 알드리치	546127	99 % 순도
집중 오일	Cargille	16,242	유형 DF