개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

요약

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다. 생체내에서 분석이 방법으로 얻을 수 있습니다.

초록

분할, 마이 그 레이션 및 신경 전구 세포의 분화의 정확한 패턴을 적절한 두뇌 개발과 기능 ^1,2에 중요한 있습니다. 생체내 환경에서 복잡한에서 신경 전구 세포의 동작을 이해하기 위해서는 두뇌에 손상 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상이 매우 필요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 생체내에 forebrain 신경 전구 세포의 발전을 시각화하는 zebrafish 배아의 고유한 기능을 이용. 우리는 유전자 및 띄엄띄엄 라벨 개별 신경 전구 세포에 electroporation을 사용합니다. 간단히, DNA가 형광 표식에 대한 코딩 구조 22 시간 게시물 수정 (HPF) zebrafish 배아의 전기 펄스가 즉시 배달되었고,의 forebrain의 뇌실로 주입했다. 여섯 시간 후, electroporated zebrafish의 배아는 유리 바닥 문화 요리 낮은 용융 점 아가로 오스와 함께 장착했다. 찬란 표시 신경 전구 세포는 다음 물 수영 객관적인 렌즈를 사용하여 공촛점 현미경 고정 간격 36시간 위해 몇 군데 있었다. 현재의 방법은 forebrain 신경 전구 세포의 생체내 개발에 대한 통찰력을 얻을 수있는 방법을 제공하고 zebrafish 배아의 중추 신경 시스템의 다른 부분에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. Zebrafish 태아의 준비

1. 이틀 electroporation 전에, 여성에서 남성으로 별도의 디바이더를 사용하여 야생 유형 물고기의 교배 새장을 설정합니다.
2. electroporation 전 어느 날, 전날의 새장을 짝짓기에 디바이더를 가져옵니다.
3. 배아를 수집하고 28.5에서 0.003 %의 phenylthiourea (PTU)를 포함하는 30 ML 배아 중간 ° C. 50 수정된 배아를 품어
4. electroporation의 날, dechorionate 수동으로 배아는 22hpf의 발달 단계에 도달 벌금 포셉 (Inox 5 더몬트 전자, 스위스)와 배아. 다음 PTU 0.003 %를 포함 10ml electroporation 대타의 ³ (180 MM NaCl, 5mM KCl, 1.8 MM CaCl2, 5 MM Hepes의 산도 7.2)로 배아를 전송합니다.
5. 링어이 배아를 마취 위하여 10ml의 electroporation을 420 μl tricaine 주식 (4mg/ml)를 추가합니다.

2. Electroporation 준비

1. 유리 사출 니들은 플라밍 - 브라운 P897 풀러 (셔터 인 스트 루먼....

토론

이 비디오에서는, 우리는 개발 zebrafish의 forebrain에서 clonal 수준에서 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상에 대한 방법을 보여줍니다. 우리는 유전자와 찬란 라벨 개별 신경 전구 세포에 테스트 기존의 electroporation 프로토콜에게 ^4-6을 수정했습니다. 단 몇 세포가 띄엄띄엄 electroporation의 상대적인 낮은 전압으로 표시 이후 clonally 관련 자손 세포로 구성된 혈통의 나무가 설정할 수 있습니다. EGFP뿐만 아니라, 신경 전구 세포 subcellularly 단순히 다른 형광 마커와 EGFP를 대체하여 다양한 형광 단백질이 표시하실 수 있습니다. EF1α - GFF는 UAS - E1B - memberane - EGFP와 UAS - E1B - H2B - mRFP 공동 electroporated있다면 핵은 적색 형광 단백질이 표시됩니다 반면 예를 들어, 각각의 전구 세포의 세포막은 녹색 형광 단백질이 표시됩니다. 라이브 영상 중에 관찰 electroporat.......