인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

요약

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

초록

의 DNA microarrays은 병원균 검출을위한 강력한 도구로 부상했습니다. 예를 들어 ^1-5를 입력하고, subtype의 독감 바이러스에 대한 능력의 많은 사례가 증명하고 있습니다.의 DNA microarrays에 독감의 ^6-11 식별 및 subtyping은 모두 공개 응용 프로그램을 가지고 건강과 조기 발견, 신속한 개입, 그리고 인플루엔자 유행의 영향을 최소화를위한 병원. 전통적인 형광 현재 가장 일반적으로 사용되는 microarray 검색 방법입니다. microarray 기술은 임상 사용을 향해 진행 그러나, ¹ 저비용 탐지 기술은 형광과 비슷한 성능 특성을 전시와 함께 고가의 장비를 대체하는 것은 microarray assays 더 매력적이고 비용 효율적인 것입니다.

ampliPHOX colorimetric 탐지 기술 연구 애플 리케이션을위한, 그리고 형광 microarray에 필요한 공촛점 microarray 스캐너에 비해 대략 10 배로 낮은 악기 비용중인 주요 장점과 함께, 전통적인 형광 ¹¹ 크기 중 하나를 순서 내에서 감지 한계를 가지고있다 감지. 또 다른 장점은 기존의 형광 악기와는 달리, 이동성과 유연성 수있는 악기의 컴팩트 사이즈입니다. 중합 기술 형광 감지만큼 본질적으로 선형되지 않기 때문에, 그러나, 그것은 최고의 같은 병원체 검출 배열에 관해서는 특정 순서의 존재에 대한 예 / 아니오 대답이 원하는되는 낮은 밀도 microarray 어플 리케이션에 적합합니다. 현재 ampliPHOX 감지와 호환 최대 현장 밀도 ~ 1800 장소 / 배열입니다. 때문에 현장 밀도 제한의 높은 밀도 microarrays은 ampliPHOX 감지에 적합하지 않습니다.

여기, 우리는 인플루엔자 바이러스의 검출 및 특성 (FluChip)에 대한 개발 저밀도 microarray에 신호 증폭의 방법으로 ampliPHOX colorimetric 탐지 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 ampliPHOX 감지, 비슷한 방식으로 표시하고 감지할 수 biotinylated 목표를 통합하는 microarray 중 하나가 특정 응용 프로그램으로 FluChip을 (DNA microarray)를 사용하지만. 캡쳐하는 대상의 microarray 디자인과 biotinylation은 사용자의 책임입니다. biotinylated 대상이 배열에 캡처되면 ampliPHOX 감지가 먼저 태그에 의해 streptavidin - 라벨 공액 (ampl​​iTAG)로 배열을 수행할 수 있습니다. 단량체 솔루션의 ampliPHOX 리더 악기, 중합을 사용하여 빛의 노출시 (ampl​​iPHY) ampliTAG - 표시 대상을 포함하는 지역에서만 발생합니다. 형성된 고분자는 연속적 간단한 소프트웨어 패키지 (ampl​​iVIEW)을 사용하여 이미징 및 분석 다음 영상 대비를 향상시킬 수있는 무독성 솔루션을 물들일 수 있습니다. 결과 해제 추출 샘플에서 전체 FluChip 분석은 약 6 시간 수행할 수 있으며, 위에서 설명한 ampliPHOX 탐지 단계는 약 30 분 안에 완료할 수 있습니다.

프로토콜

1. RT - PCR을 사용하여 샘​​플 증폭

1. 임상 자료나 바이러스 QIAcube 자동 핵산 추출 플랫폼과 함께 Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 분리.부터 바이러스 RNA를 추출 Extractions은 60 μl의 최종 용출 량 200 μl 표본에서 수행됩니다. -70에서 보관 추출물 ° C 또는 나중에 사용하기 위해 낮은.
2. 템플릿 자유 영역에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 얼음의 RT - PCR 마스터 믹스를 준비합니다. RT - PCR 중에 비오틴을 통합하려면, dNTP 혼합 제공된 제조 업체의 자리에 biotinylated dNTP 혼합물을 사용합니다. biotinylated dNTP 혼합물을 사용하는 비용은 1 달러 미만 USD / 분석이다. biotinylated 프라이머의 사용과 같은 비오틴의 정관의 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 추가 프라이머는 독감을위한 1.0 μm의 최종 농도로 혼합, 인플루엔자 B에 대해 1.0 μm의 및 내부 통제를위한 0.14 μm의. 독감은 프라이머 세트는 매트릭스 유전자 세그먼트 (1032 NT 제품)를 증폭하고 독감 B 프라이머 세트가 아닌 구조 유전자 세그먼트 (811 NT 제품)을 증폭. 각 FluChip 프라이머 세트는 다음과 PCR 람다 exonuclease와 효소 소화를 ....

토론

여기에 제시 ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 낮은 밀도 microarray 애플 리케이션을위한 단일 색상 형광 검출에 대한 신속하고 저렴한 대안입니다. 그림 1에 간략하게 구조와 같이 검출 원리는 photoinitiator 라벨 (1B)의 사용에 따라 달라집니다. 단량체 함유 용액 (1C)의 존재에 빛이 노출 photoinitiator (ampl​​iTAG)가에만 표시 지역의 중합 반응 (1D) 실행하도록합니다. 인플루엔자 식별 및 subtyping을위한 DNA 배열에 여기 보여주지만,이 기술은 microarray에서 캡처한 모든 biotinylated 제품을 감지하는 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 시약 화학을 사용하는 photopolymerization 기반 감지에 대한 이전의 작품은 핵산과 항체 기반 배열 모두에서 증명되었습니다. ¹² 기타 또한 photopolymerization 기반 시스템의 항체와 단백질 기반의 애플 리케이션을위한 개념의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 장비	제조 업체	카탈로그 #	댓글
Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트	Qiagen	57,704	싱글 60 μl 용리
QIAcube	Qiagen	9,001,292	옵션
ABI 9800 빠른 열전달 자전거 타는 사람	응용 Biosystems	4,441,166
Qiagen RT - PCR OneStep 키트	Qiagen	210210	키트는 사용하지 dNTPs
2X 구경 버퍼	InDevR 주식 회사	MI - 5007
Biotinylated dNTP 믹스	InDevR 주식 회사	MI - 5009
람다의 exonuclease	Epicentre의 Biotechnologies	LE032K	2500 U, 10U/μl
FluChip 프라이머 믹스	InDevR	N / A	판매 아직 없습니다
올비털 쉐이크	Madell 기술	ZD - 9556 - A
방식 와시	InDevR 주식 회사	MI - 4002
랙 와시	InDevR 주식 회사	MI - 4003
2X 하이브리드화 버퍼	InDevR 주식 회사	MI - 5004
보정 칩	InDevR 주식 회사	AP - 5006
버퍼에게 광고를 와시	InDevR 주식 회사	MI - 5005
ampliRED	InDevR 주식 회사	AP - 5004
ampliTAG	InDevR 주식 회사	AP - 5001
2X ampliTAG 버퍼	InDevR 주식 회사	AP - 5002
ampliPHY, ampliPHY 향상제	InDevR 주식 회사	AP - 5003