zebrafish 배아에서 alkyne - 태그 glycans의 급속한, 비침 투, 그리고 강력한 라벨을 허용 클릭 화학 기반 방법을 설명합니다. 후반 gastrulation 단계에 zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 Fucosylated glycans이 연구에서 몇 군데 있었다.
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방법 논문
신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans
이 논문에서
요약
초록
생체내의 이미징 glycans 최근 azide 또는 alkyne - 태그 단당류 1, 2 세포 또는 유기체를 처리하여 bioorthogonal 화학 기자 전략을 사용하여 활성화되었습니다. glycan의 biosynthetic 기계에 의해 처리 수정 단당류는, 세포 표면 glycoconjugates에 통합됩니다. bioorthogonal azide 또는 alkyne 태그 다음 시각화를위한 형광 프로브와 공유 결합 결합을 허용하거나, 농축 및 glycoproteomic 분석을위한 화성 탐사선과. 의 뒤덮었 레이어 fucosylated glycans를 라벨 GDP - 5 - alkynylfucose (GDP - FucAl), 2 하나의 세포 단계의 배아 1) microinjection) :이 프로토콜을 포함하여 일반적으로 zebrafish 배아에서 fucosylated glycans의 비침 투 이미징에 사용되는 절차를 설명 공촛점 현미경 3 biocompatible 잘라내기 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition의 (CuAAC), 3) 영상을 통해 azide - 복합 fluorophores와 zebrafish 배아. 여기에서 설명한 방법은 쉽게 glycans의 다른 클래스, sialic 산성 4 N - acetylgalactosamine 5, 6를 포함하는 예 glycans 개발 zebrafish과 다른 살아있는 생물에을 시각화하기 위해 확장될 수 있습니다.
프로토콜
1. 에그 수집 및 Dechorionation
- 수집 및 35mm 페트리 접시에 zebrafish 달걀을 전송, 가능한 한 많은 물을으로 제거한 다음 E3 배아 매체 1 MG / ML Pronease 전자 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2 · 2 시간 2 O, 0.33 MM MgSO을 추가 chorion을 소화하기 위해 4, 산도 = 7.4).
- 3~5분 후, 생선 물 (리터 60 MG "인스턴트 오션 '소주 H 2 O)로 가득 비커에 요리를 병합하고, 부드럽게 비커에 달걀을 전송하고 계란 물을에"가을 "수 있습니다.
- 생선 물 세 번와 계란을 씻어. 대부분의 달걀들은 chorion에서 발표됩니다.
- 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 E3 배아 매체 가득 아가로 오스 - 코팅 배양 접시에 dechorionated 달걀을 전송합니다.
2. GDP - FucAl로 Microinjection
- 보고된 7 번 프로토콜 다음과 같은 사출 요리를 준비합니다.
- E3 배아 매체 가득 주입 요리에 de....
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토론
이미징 biomolecules 생체내에 자신의 모국어 환경에서 자신의 생물 학적 활동의 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish 배아의 뒤덮었 계층에 fucosylated glycans의 라벨이 BTTES - 중재 biocompatible CuAAC 통해 GDP - FucAl 하나의 세포 단계의 배아와 두 번째 단계 형광단의 활용을 microinjecting하여 실현하는 방법을 보여줍니다 3. 강력한 라벨이 2~3분 이내에 얻을 수 있으며, 라벨 glycans 2.5 HPF 빠르면 감지됩니다. 중요한 것은, GDP - FucAl의 단일 복용 96 HPF까지 감지 alkyne 종속 형광 신호를 얻을 수 있습니다. 동일한 접근 방식은 두 개의 연속 CuAAC 통해 zebrafish을 개발 alkyne - 태그 fucosides의 거래를 모니터링하는 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 실험에 확장될 수 있습니다. 그러나, 라벨은 클릭 화학 시.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 시작 자금,이 작품은 부분적으로 국민 건강의 연구소 (RDS에 3U54AI057158 - 06S1 PW로 GM093282)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 구리 (II) 황산염의 pentahydrate | 시그마 - 알드리치 | 203165 | |
| 알렉사 플루어 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, 알렉사 플루어 594 | Invitrogen | D - 22913 | |
| (+) - L - 아스코 브 산 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic 산성 | Acros의 생명체 | 164060010 | |
| 유리 바닥 microwell 요리 | MatTek | P35G - 1.5-14 - C |
참고문헌
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D.
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재인쇄 및 허가
