죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
상피 조직의 생체 항상성 유지 보수 장벽 기능을 중단하지 않고 손상된 세포의 지속적인 제거가 필요합니다. 우리의 연구는 죽는 세포는 출구에서 결과있을 수있는 격차를 닫는 동안 상피 시트에서 밖으로 배출 굴지과 마이 오신의 고리를 형성하고 계약에 그들의 사는 이웃에게 신호를 보내는 것을 발견, 과정은 세포 압출 1 칭했다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기서 우리는 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다. 압출을 시각화하기 위해, 우리는 표피의 녹색 형광 단백질을 표현 한 세포 단계의 배아 유전자 변형 zebrafish에 F - 굴지의 적색 형광 단백질로 분류 프로브를 삽입하고 애벌레로 G418를 추가하여 apoptosis를 유도. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출의 과정에서 굴지의 역학과 상피 세포의 행동을 관찰하기 위해 회전하는 디스크 공촛점 현미경에서 시간 저속 이미지를 사용합니다. 이러한 접근 방식은 우리가 살고 상피 조직에서 압출 프로세스를 조사 수 있으며 apoptotic 세포를 제거하기 위해 실패로 인한 질병 상태를 연구하는 수단을 제공합니다.
프로토콜
개발 Zebrafish의 표피에서 셀 압출 동안 굴지 역학 시각화의 기본 워크플로우
개발 zebrafish의 표피는 별개의 두 레이어, 표면 레이어 (또는 periderm)과 지하 막 2 연락 세포의 기저 계층으로 구성되어 있습니다. 외부 표면 층의 세포가 apoptosis를 받아야하고 압출 3 (그림 1)에 의해 조직에서 제거됩니다. 실시간으로이 과정을 시각화하기 위해, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP를 표현 한 세포 단계 형질 전환 zebrafish에 utrophin, 굴지 바인딩 단백질 (RFP - UtrCH) 4,5의 calponin의 상동 도메인에 융합 RNA 인코딩 적색 형광 단백질을 주입 ) 층상 상피 조직 모터 cytokeratin 8 6 (그림 2A)에서. RFP - UtrCH이 ubiquitously RNA 주입 후 동물의 표현이지만, 우리는 RFP 및 GFP 모두 표피 (그림 2B)에 구체적으로 굴지 역학을 따르도록 표현 외면 표피 세포에 중점을두고 있습니다. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출 및 이미지 회전하는 디스크 공촛점 현미경을 사용하여 표....
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토론
여기에서 설명한 프로토콜은 실제 상피 조직에서 압출하는 과정을 시각화하는 간단하고 직접적인 방법을 보여줍니다. 이런 유형의 실험은 우리가 이전에 고정 조직 분석에서 평가하지 굴지 역학 미묘을 확인하실 수 있습니다, 따라서, 일반적인 immunofluorescent 방법을 보완합니다. 로 우리는 더 염증 반응이나 손상된 세포의 축적으로 이어질 것입니다 우리가 기대 apoptotic 세포를 제거하고 취소하고 실패와 관련된 압출 과정과 학습 질병 상태를 분석 화학 억제제 또는 유전자 돌연변이와 함께이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 암에서 본. 예를 들어, 저희 연구실은 이전에 화학 억제제가 방향 세포는 extrudes 3 효과 세포의 basolateral 표면을 따라 굴지의 필라멘트의 타겟팅을 변경할 수 G418와 함께 사용할 수 나타났습니다. 현재 방법 중 하나 제한이 세포 사망의 확률과 예측 불가능한 자연으로 인해 우리의 데이터 세트는 압출의 나중 단계에 집중하는 경향이있다. 다세포 굴지 링과 수축의 개시의 .......
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공개 사항
동물 복지 보증
zebrafish, Danio rerio를 사용하여이 절차를 수행 모든 절차는 기관 동물 케어 승인 및 (동물 복지 보증 # 10-07017) 유타 대학위원회 (IACUC)를 사용하고 있습니다.
감사의 글
우리는 과학적인 토론, 제안 및 의견에 대한 Rosenblatt 연구소의 회원 감사합니다. GFP 유전자 변형 zebrafish : 우리는 또한 친절 CK를 제공하는 플라스미드 인코딩 RFP - UtrCH와 데이비드 그런왈드를 제공 메리 할로란 감사하고 싶습니다. 감사합니다 또한 그레첸 왕의 zebrafish 우수 유지 보수 및 관리를위한 유타 대학에서 중앙 Zebrafish 자원의 직원. 이 작품은 JR을 OD002056 - 01 DP2 NIH - NIGMS NIH 원장의 새로운 이노 상 1 지원했다. GTE는 NIH 종합 암 교육 프로그램 그랜트 5T32 CA03247 - 8에 의해 지원되었다.
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참고문헌
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y.
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재인쇄 및 허가
