절연, 환기 및기구 마우스 폐의 특성화는 타악기 흐름 Perfused

요약

다음 프로토콜은 환기를 분리하고 오른쪽 심실 afterload에 혈액의 흐름, 공기 흐름,기도 변화와 혈관 변화의 효과를 계량하기 위해서는 안정이나 타악기 폐동맥 혈관 압력 유량 관계를 측정하는 마우스 폐가 instrumenting 과정을 설명합니다.

초록

절연은 환기 및기구 마우스 폐 준비는 안정과 타악기 폐동맥 혈관 압력 유량 관계가 폐 동맥 유량, 유량 파형,기도 압력과 왼쪽 심방 압력 이상의 독립적인 컨트롤과 함께 측정할 수 있습니다. 폐 혈관 저항이 멀티 포인트, 지속적인 압력 - 유량 곡선을 기준으로 계산되며 폐동맥 혈관 임피던스는 주파수의 범위에서 얻은 타악기 압력 유량 곡선에서 계산됩니다. 그것이 무시할 수없는 혈관 준수의 영향, 특히 폐동맥 순환에 포함되어 있기 때문에 현재 임상 인식으로, 임피던스는 저항보다 오른쪽 심실 afterload의 우수한 측정하기위한 한 방법입니다. 임피던스 세 중요한 통계 수치 - 제로 헤르츠 임피던스 Z _0, 특성 임피던스 Z _C 및 전파 반사 R _W의 색인 - 흐름에 사용할 수 말초 동맥 단면적, 근위 동맥 강성과 상류 - 하류 임피던스에 대한 통찰력을 제공합니다 불일치, 각각. 고립에서 얻어진 모든 결과는, 환기 및 perfused 폐 동정 신경계 톤, 볼륨 상태 및 마취의 효과에 독립적입니다. 우리는 폐의 emboli과 저항 및 임피던스에 대한 만성 hypoxia의 영향을 계량이 기술을 사용 있고, Z _C의 압력 의존성을 사용 vasoactive 요원과 질병의 행동 사이트 (즉, 근위 대 말초) 구별할 수 있습니다. 또한, 이러한 기술은 마우스의 유전자 조작 종자의 폐에와 함께 사용하는 경우, 폐의 혈관 구조와 기능에 대한 분자 수준의 결함의 영향을 확인할 수 있습니다.

프로토콜

Tuchscherer 외,이 프로토콜에서 우리는 이전에 타악기 폐의 혈관 압력 유량의 관계에 대한 폐 emboli과 만성 hypoxia의 영향을 (Tuchscherer, 웹스터, & Chesler 2006 년 계량하는 데 사용되었습니다 절연, 환기, perfused 마우스 폐 준비를 보여줍니다 ., 2007). 간단히 마우스 폐는 수술 가열 챔버에 배치, 주변 조직으로부터 격리 (IL - 1, 하버드 장치, 홀리스튼, MA)하고 통풍 (Ventilatory 제어 모듈 (VCM) - R 타이머 카운터 모듈 (TCM)를, 하버드 장치). 폐 vasculature은 지속적인 흐름 파형 또는 고주파 oscillatory 펌프 (보스 - 전기 힘, 에덴을 생성하는 주사기 펌프 (콜 - 파머, 버논 힐스, IL)를 사용하여 3.5 %의 Ficoll 온수 RPMI 1640 세포 배양 매체와 perfused입니다 타악기 폐 혈관 흐름 파형을 만들 수있는 주사기 펌프와 병행하여 프레리, MN). 압력 트랜스 듀서 (P75, 하버드 장치)는 순간 폐동맥 압력 (PAP)와 왼쪽 심방 압력 (무릎)를 측정합니다. 순간 유량 (Q)는 인라인 유량계 (천음속 시스템즈, 이타카, 뉴욕)와 측정됩니다. 타악기 압력 - 유량 관계가 폐 혈관 생리학 및 병리학과 오른쪽 심실 afterload에 대한 통찰력을 제공합니다 이러한 측정에서 파생됩니다.

1. 장비 :

1. 설정 마우스 환풍기를 포함한 절연 폐
2. 데이터 수집 시스템 및 LabView 프로그램과 컴퓨터
3. perfusate 흐름에 대한 두 개의 압력 변환기 및 유량계
4. 기도 흐름에 대한 압력 변환기 및 유량계 (pnemotachometer)
5. 승 테스트 프로그램과 함께 높은 주파수 oscillatory 펌프 및 컴퓨터
6. 붐 / 줌 현미경, 램프
7. IL - 1 시스템에 대한 높은 출력 펌프 난방 목욕탕

2. IL - 1 시스템을 준비

1. 증류수는 ° C IL - 1 시스템의 내부로 순환되는 난방 목욕탕에 의해 37 가열.
2. 모든 펌프, 트랜스 듀서 및 IL - 1 정맥은 깨끗한 튜브를 통해 연결되며 모든 튜브는 37 가열 증류수 ° C.로 플러시됩니다 폐 및 원인 부종으로 여행할 수 기포는 제거되어야합니다. 흐름 센서에 oscillatory 흐름 펌프로부터 유량 센서에서 폐동맥의 정맥에 튜브가 1% PBS로 플러시됩니다.
3. P75 압력 트랜스 듀서는 정맥에 밸브를 닫는 분위기에 밸브를 열고 다음 PLUGSYS 증폭기에있는 자동 제로 버튼을 눌러서 제로 있습니다. 그런 다음 대기 밸브가 닫히고 정맥에 밸브가 열립니다.
4. IL - 1 시스템의 환기 경로의 세라믹 다공성 조각은 습기를 제공하기 위해 침수입니다.

3. 솔루션

1. 볼륨 Ficoll - RPMI 솔루션과 살균 필터 미디어의 3.5 %를 준비합니다. 미디어를 필터링하는 것은 본의 아니게 폐를 embolize 수있는 더 큰 입자가 없다 보장합니다. 멸균 미디어를 사용하면 폐암의 개발 갑자기 부종의 가능성을 줄여줍니다. 각 실험 재판 RPMI로 수술 한 60 ML의 주사기에 대한 RPMI 한 10 ML의 주사기를 채우십시오. 37 ° C의 물을 욕조에 perfusate을 가열.
2. 마우스 (대략)의 헤파린 500IU/100g 체중 1ml를 준비합니다. 헤파린 소금 158IU/mg입니다. ~ 25g의 마우스, 작은 microcentrifuge 관에서 1ml PBS 솔루션 1.25 MG 헤파린 소금을 섞는다.

4. 환기 마우스

1. 마우스로 kg 당 솔루션 pentobarbital 150 MG, 발에서 하드 핀치를 수행하여 깊은 마취를 보장의 intraperitoneal 주사 후. 아무런 반응이 없다면, 안정성 corkboard하기 위해 앞 발톱을 달아하여 수술 마우스를 준비합니다. 참고 : 실험 마취 깊이를 통해 신중하게 동물을 관찰하여 감시하고 있습니다. 발톱과 자주 incisions에 핀은 유해 자극, 동물 마취의 수술 비행기에 남아있는 것을 확인하기 위해 응답의 부족으로 작동합니다.
2. 모피를 습식 및 목의에서 피부를 잡아 바로 집게를 사용하여 95 % 알코올로 가슴 스프레이. 바로 가위를 사용하여 피부에 개방 1cm 컷.
3. 목 안쪽이 노출되면, 식도 및 호흡 관을 찾는 모든 하얀 선의 조직과 피상적인 근육을 제거하십시오. 양쪽 및 후부로의 조직에서 식도와 기관을 분리.
4. 기관에서 작은 벤트 포셉를 삽입하고 반대쪽에 봉합 한 조각을 들고. 기관에서 봉합사를 당겨하고 느슨한 외과의 매듭을 짓고. 봉합사를 강화하거나 매듭하지 마십시오.
5. 작은 가위로기도에있는 작은 직각 "V"를 절단하고,기도를 통해 모든 방법을 깎지 않아. 온수 IL - 1 시스템에 코르크 보드와 마우스를 이동합니다. 두 무딘 집게를 사용하여 tracheal 정맥과 'V'아래의기도를 잡아. 그런 다음 trach에 tracheal 정맥을 슬라이드"V"오프닝을 통해 EA. 기관 주위 봉합과 기관 내부의 정맥을 확보하기 tracheal 정맥를 조이십시오. 매듭을 묶게.
6. 실내 공기와 환기 (50 % 영감, 깊은 영감과 90 숨을 / 분) 시작합니다.

5. 통풍 마우스 Perfusing

5.1. 헤파린을 주입하기 위해 우심실에 액세스

1. 또 알코올 스프레이 마우스 가슴 모피를 다시 서부 유럽 표준시합니다. 직선과 직선 포셉 가위를 사용하여 갈비뼈 위에 가슴에 피부의 모두 제거합니다. 흉골을 따라 위쪽으로 잘라. 양쪽에있는 피부를 리프트 다음 낮은 갈비의 선을 따라 피부를 잘라.
2. 핀셋으로 흉골의 하단에있는 칼 모양의 프로세스를 파악하고 바로 가위를 사용하여 횡경막에 구멍을 뚫고. 핀셋으로 피임기구를 잡고 갈비에서 버려야.
3. 족집게로 다시 칼 모양의 프로세스를 파악 (왼쪽)와 흉골을 자르고 갈비뼈를 통해 볼 - 팁, 직각 가위를 사용하여 폐를 잘라하지 않도록주의하고, 심장이나 혈관은 (에있는 볼 - 팁을 사용하여 가위)는 당신을 안내합니다. 이 피가되지만 한 가위의 최첨단이 흉골 반대로 심장과 폐가 절단되지 않습니다.
4. 왼쪽에있는 갈비뼈를 파악하고 많은 갈비의 마음을 노출 필요 버려야. 천천히 0.1 ML의 헤파린 솔루션 우심실을 주입. 이 단계는 내피 세포를 손상과 재관류에 악영향을 줄 것이다 폐에 혈전을 방지하는 것이 중요합니다. 심장 박동 아직도있는 동안 헤파린을 주입해야합니다.

5.2. 주 폐동맥을 Cannulate

1. 부드럽게 떨어져 갈비뼈 벽에서 폐를 밀어 다시 (반올림) 포셉 끝을 사용하여 갈비의 나머지 부분 (왼쪽과 오른쪽)을 버려야. 폐 잡아 자체가 섬세한 조직을 손상합니다. 가위 도움말 및 폐 조직 사이의 부수 접촉은 또한 손상을 일으 킵니다.
2. 폐 이상의 장소에 현미경을 이동합니다. 심장의 상단에있는 선의와 지방 조직을 버려야. 동맥과 정맥에서 떨어져 끌어와 조직이 긴장에있는 동안 다음 봄 가위로 잘라 핀셋을 사용합니다.
3. 핀셋 다른 무딘 설정 아트리움 / 대동맥과 폐동맥 (PA)에서 핀셋의 끝부분을 얻기 위해서는 뇌실 왼쪽 아래에 심장의 상단에서 오른쪽에서 왼쪽으로 특종을 사용합니다. 이렇게 조심스럽게 - 거기에 핀셋으로 저항해서는 안됩니다. 무딘 핀셋을 사용하면 실수로 폐동맥이나 대동맥을 펑쳐링의 가능성을 줄여줍니다.
4. 트위터 팁은 대동맥과 PA 미만되면 봉합의 한 조각을 잡고 이겨낼. 느슨한 외과의 매듭을 묶게. 봉합사를 강화하거나 매듭하지 마십시오.
5. 선택 사항 : 신체의 아래쪽 절반을 제거하는 직각 가위를 사용합니다. 갈비뼈와 척추를 통해 아래를 잘라, 대동맥을 절단하고 베나 카바이 흐름에 혈액의 상당량을 초래하게됩니다 - 물이 새지 않는 흐​​름에 Q - 팁을 사용합니다. 처분에 대한 봉투에 넣습니다.
6. RPMI의 10 ML의 주사기에서 4 ML과 수상 PA 정맥. 모든 튜브 기포가 무료입니다 있는지 확인을 두 번. 증류수 또는 거품과 폐의 재관류은 부종을 초래합니다.
7. 오른쪽 심실 무료 벽에 작은 노치 잘라 PA 정맥을 삽입, 아래 목표로하고 오른쪽으로. 정맥의 끝은 PA의 투명한 벽을 통해 볼 수 있습니다. 당신의 위치를​​ 확인하기 위해 RPMI의 작은 금액을 달이다. 정맥, 대동맥 및 PA 주변의 봉합사를 강화하고 매듭을 묶게. 좌심방이 cannulated 때까지 실제 재관류 시작해서는 안 그럼이 시점에서, 대동맥도 해제 매듭입니다.

5.3. 좌심방을 Cannulate

1. 좌심실의 하단 부분에 노치를 잘라 불활성 왼쪽 심방 (LA) 정맥, 위쪽 목표. 약간의 압력이 방향으로 승모판를 열 필요가있을 수 있습니다. 올바른 위치에서 정맥 팁 통과 실수 봉합하지 않고 안전합니다.

5.4. 재관류를 시작

1. RMPI가 유출 관 (맑은 PBS 달리 핑크색 봐야죠 색상)에서 확연히 때까지 수동으로 분당 0.3 ML에서 10 ML의 주사기에서 RPMI를 달이다. 유출 관, 다시 위치 LA 정맥에 흐름이없는 경우. 아무 유출을 다시 위치와 함께 얻을 수 없습니다 경우, 폐동맥에 누출이 있는지 확인합니다. 폐동맥의 누출이나 눈물은 복구할 수 없습니다,이 실험을 중단에 대한 원인이됩니다.
2. IL - 1 시스템을 통해 PA 정맥에 60 ML의 주사기를 연결하고 누수 확인 및 폐 RPMI가 폐에 혈액을 교체는 것을 보여주는, 흰색으로 바뀝니다 확실히 만드는 perfusate의 1ml/min 주입을 시작합니다. 2 분 동안 느린 흐름 Perfuse.

6. 타악기 및 꾸준한 폐 압력 흐름 관계를 측정

1. 타악기 흐름 연구, 처음에는 oscillatory 펌프 피스톤 변위를 설정이전 실험에 기초하여 WinTest 프로그램의 각 주파수에 대해 원하는 수준. 폐 구조와 역학에 인해 변화는 변위 각 마우스에 따라 조정해야합니다. 원하는 수준의 지속적인 흐름을 설정합니다. oscillatory 펌프에 밸브를 열고 바로 oscillatory 흐름 프로필 (Wintest 프로그램)을 실행하기 전에 녹화 데이터를 시작합니다. 데이터 파일을 열고 Excel에서 실험 흐름 (Q)를 플롯. Q 맥스와 Q 분이 원하는대로되도록 각 주파수에서 oscillatory 펌프 피스톤 변위를 조정 (Wintest 프로그램).
2. 꾸준한 흐름 재판은 oscillatory 펌프에 밸브를 닫습니다. 이 밸브가 열려 남아있는 경우, oscillatory 펌프 또 다른 하나의 유량의 변화를 댐퍼닝, 커패시터 역할을합니다. 각각의 유속이나 PA의 압력까지 최소 10 초 동안 데이터를 수집 이상 5 % 변경되지 않습니다.
3. 타악기 또는 지속 중 유량 측정, 데이터 수집하기 전에 일정한 압력에서 오래된 환기. 즉시 데이터 수집 후 통풍을 재개하라.
4. 기도 튜브에 RPMI 살펴보십시오,이 부종의 증거이며 실험을 중단에 대한 원인이됩니다. 또한,이 트랜스 듀서를 손상시킬 수 있기 때문에 RPMI은기도의 압력 또는 유량 센서에 도달해서는 안된다.

7. 대표 결과 :

대표 스테디 결과 :

격리 폐에서 설정 실험자들은 독립적으로 제어뿐만 아니라 폐의 흐름 Q 능력뿐만 아니라기도 압력 P _공기와 왼쪽 심방 압력 랩 있습니다. Q, P _공기와 무릎이 폐동맥 vasculature하고 그 결과 폐동맥 압력 PAP에 영향을 미치는 때문에 유리한 것입니다. 또 다른 장점은 얻은 결과는 교감 신경계 톤 ¹ 볼륨 상태 및 마취 ² 무관한 것입니다.

고정 P _공기에 대한 Q의 계단 단계의 변화에 의해 유발하거나, 고정 또는 무릎 다양한 PAP 변경은 그림 1에 표시됩니다. 격리된 폐 준비에 랩 정맥은 일반적으로 폐기물 컨테이너에 perfusate을 이끌고 튜브에 연결합니다. 장소에이 튜브로, 무릎은 Poiseuille 흐름으로 인해 Q에 선형적으로 의존한다. 그러나, 콘센트 및 폐기물 컨테이너의 높이를 수동으로 상수가 아닌 제로 무릎을 제공하도록 조정하거나 튜브는 Q.의 독립 영 무릎을 허용하도록 제거할 수 있습니다

대표 타악기 결과 :

임의의 타악기 흐름 파형이 시스템을 생성할 수 있지만, 우리는 일반적으로 양식의 흐름을 생성 Q = 3 + 2 죄 (2 F πt) ML / F = 1, 2, 5, 10, 15 및 20 Hz의 주파수에서 분 폐동맥 vasculature (맨 위 패널 그림 2)의 선형 임피던스를 평가합니다. 결과 PAP, 무릎 및 Q 측정에서 폐동맥 혈관 임피던스 크기 (Z) 및 위상은 (θ) 먼저 일련의로 각각 부과 사인 유량 주파수에서 ΔP = PAP - 무릎 및 Q 중 하나 가득 사인 사이클을 분해하여 계산 푸리에 변환을 사용하여 사인 하모닉스. 압력의 비율 변환 수율에게 진도 Z 및 위상 θ가있는 폐동맥 vascualar 임피던스, PVZ = FFT (ΔP) / FFT (Q)를 흐름 변환. 입력 임피던스 Z _0, 특성 임피던스 Z _C 및 전파 반사 R _W의 인덱스는, 임피던스 크기의 계산됩니다. 특히, Z ₀ 모든 주파수 이상, Z _C가 첫 번째 최소 (5 Hz에서) 20 Hz에서 사이에 Z의 평균으로 계산 평균하고, R _{W 계산됩니다} 0번째 조화 (F = 0 Hz에서)에서 Z부터 계산됩니다 로 (Z ₀ - Z _C) / (Z ₀ + Z _C) ^3.

그림 1 꾸준한 흐름 파형 (맨 윗줄)과 결과 압력. (두 번째 행 : PAP, P _공기, 무릎) 무릎 및 P _공기의 다른 조합과 시간의 함수로. 아래 행은 (A)와 (B), Q와 무릎이 증가와 감소가 유출 관이 자리에 있기 때문에 Q. 대에서 PAP를 보여줍니다. 이 튜브는 그 무릎가 지속 및 Q. 독립되도록 (C) (D)와 무릎이 이상하지만 Q. P _공기의 독립이되도록 (E) 아울렛 튜브의 높이를 수동으로 조정했다 예전에 어느되었습니다 위해 제거되었습니다 최종 inspiratory (A, C, D) 또는 최종 날숨 (B, E) 압력.

그림 2 타악기 흐름 파형 Q (맨 위 패널) 및 결과 압력 (하단 패널 : PAP, 무릎 및 P _공기.) 시간의 함수로. 이러한 타악기 폐동맥 압력 유량 관계에서 PVZ는 총 오른쪽 심실 afterload를 반영하는, 계산하실 수 있습니다.

토론

수술의 중요 단계

이것은 폐 떨어져 갈빗대를 절단하면 치료가 함락되는 것이 중요합니다. 폐 완전히 노출과 노골적인 주변 조직에 의해 인플레이션 중에 있지만 고립의 과정에서 손상되지해야합니다. 포셉의 백 엔드와 같은 평면 객체의 사용은 줄일 가위에 대한 명확한 경로가되도록 가슴 벽 가까이 폐를 개최하는 데 사용할 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 폐동맥과 대동맥 주위 봉합의 위치입니다. 무딘 직선 핀셋을 사용하면 폐동맥을 펑쳐링의 위험을 줄일 수 있습니다. 수술 중에 마지막 중요한 단계는 cannulas의 위치입니다. cannulas들이 마음을 출구로 큰 혈관의 비행기 위에 너무 높은 경우, cannulas는 폐동맥이나 폐동맥 혈관 중 하나를 당겨 수 있습니다. 좌심방에있는 정맥이 너무 낮으면, 그것은 왼쪽 폐에 흐름을 차단할 수 있습니다. 그 결과, 더 많은 흐름 PAP 증가하고 오른쪽 폐 부종의 발전을 hastening, 오른쪽 폐로 이동합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 ml 주사기	Fisher Scientific	14-829-10F
10 ml 주사기	Fisher Scientific	14-823-2A
60 ml 주사기	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI GLN 6/PK	포함 Fisher Scientific	MT10040CV
보틀 탑 필터	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
헤파린	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
각진 공 홍채 가위	Fine Science Tools	14109-09
Vannas Spring Scissors - 4mm 블레이드	Fine Science Tools	15018-10
Fine Iris Scissors - 스트레이트	파인 사이언스 도구	14106-09
Dumont #5/45 겸	정밀 과학 도구	11251-35
Dumont Medical Biology 겸	정밀 과학 도구	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Isolated 관류 마우스 폐 시스템	Harvard Apparatus	739904
PLUGSYS 모듈 용 혈압 변환기 P75	Harvard Apparatus	730020
TS410 유량 모듈	Transonic	TS410
ME 4 PXN 정밀 PXN 인라인 유량 센서	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer 다중 주사기 펌프	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG / ML 20ML 바이알	Amatheon