의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

요약

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

초록

세포 극성 동적으로 배아 개발 ^{1, 2} 중 내장 및 외부 양쪽 요인에 의해 규제됩니다 진핵 세포의 기본 속성입니다. 이 규정에 관련된 신호 경로 중 하나는 embryogenesis 동안 여러 번 사용하고 인간의 질병에 ^{3, 4, 5에} 중요합니다 Wnt 경로입니다. 이 경로의 여러 분자 구성 요소는 coordinately 공간 제한 방식으로 신호를 통제하지만 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. Xenopus 배아 상피 세포가 다양한 신호 단백질의 subcellular 지방화를 공부하는 우수한 시스템입니다. 형광등 융합 단백질은 RNA의 microinjection에 의해 Xenopus의 배아에서 표현, ectodermal의 explants 준비하고 단백질 지방화는 epifluorescence에 의해 평가됩니다. 이 실험 프로토콜에서 우리는 Diversin, 신호 및 세포 극성 결정 ^{6, 7에} 연루되어 세포질 단백질의 subcellular 지방화는 Wnt 신호 전달 ⁸ 공부 Xenopus ectodermal 세포의 시각이다 방법에 대해 설명합니다. Wnt 리간드 또는 Frizzled 수용체의 Coexpression 붉은 형광 단백질, RFP와 함께 융합 Diversin의 유통을 바꿀지도 모르겠어, 그리고 편광 패션 ^{8, 9에있는} 세포막에 모집. 이 전 생체내 프로토콜은 신호의 공간적 제어 손상 조직과는 다른 그리고 더 많은 어려운 분석되는 교양 포유 동물 세포의 체외 연구에서에 대한 유용한 이외해야합니다.

프로토콜

Xenopus 계란 1.에서는 체외의 수정

1. 실험 전에 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12 시간과 함께 주입했다 암컷 개구리의 알을 얻을 수 있습니다.
2. 1 X 마크의 변경 링어 달걀 솔루션 (MMR) ¹⁰ 해부 testis의 작은 조각으로 체외에서 그들을 비옥의 소량의 (0.5-1 ML)로 플레이스 계란. 2-3 분 후, 계란의 전체 표면을 커버하기 위해 0.1 X MMR을 추가합니다. HCL (수산화 나트륨과 산도 8 조정) - 20 분, 달걀 젤리 코트는 3 % 시스테인에 의해 제거됩니다. 계란은 주사에 대한 (13 ° C) 0.1 X MMR 세 번와 세탁과 감기 인큐베이터에 남아 있습니다.
3. 수정된 달걀은 2-4 셀 단계 개발에 사용할 수 있습니다. 주사 들어, 배아는 3 % Ficoll, 0.5 X MMR을 포함하고있는 솔루션으로 전송됩니다.

2. RNA의 Microinjection

1. RNAS는 mMessage mMachine 키트 (앰비온)를 사용하여 선형 DNA 템플릿에서 합성 및 0.1-1 μg / μl의 주식 농도에서 RNase 무료 물로....

토론

우리는 Diversin의 subcellular 지방화를 특징으로 위의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 동물 극 explants에서 Diversin - RFP는 핵 옆에 발견되었으며 cryosections (그림 1)에서 G - tubulin, centrosomal 마커와 colocalized. 단백질의 subcellular 지방화가 확인되면, 삭제 구조는 단백질 도메인이 필요하고 subcellular 지방화 충분되는 구축 생성할 수 있습니다. 이 방법을 사용 Diversin의 centrosomal 현지화 도메인은 중간에 매핑되었습니다과 단백질의 카르복시 - 터미널 도메인에 코일 - 코일 모티브 ⁸ 포함하는 둘 다.

동일한 프로토콜은 단백질 지방화는 신호에 대한 응답으로 변경되는, 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 Wnt 분비 단백질은 세포막에 인접한 작은 반점이있는 구조로 사업부 - RFP를 변경하는 행위 발견, 반면 세포막 패치 (그림 1) Fz8 모집 .......