의 액체 기반 culturing 및 분배를위한 절차 C. 엘레간스 종자는 고가의 정렬 장비를 필요로하지 않는다는 설명이다. 이 접근법은 많은 inducible에 적용할 수 있습니다 C. 엘레간스 오염 물질의 약물 발견을위한 유전자 또는 biosensing.
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이 논문에서
요약
초록
하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 생물 학적 과정의 화학 변조기를 식별에 대한 강력한 접근 방식이다. 그러나, 세포 배양 모델을 사용하여 화면에서 확인된 많은 화합물은 종종 생체내 1-2에 독성이나 pharmacologically 비활성으로 볼 수 있습니다. 전체 동물 모델에서 상영하는 것은 이러한 함정을 피하는데 도움이 및 약물 개발에 대한 경로를 합리화 수 있습니다.
C. 엘레간스 잘 HTS 적합 다세포 모델 생물이다. 그것은 작은 (<1mm)과 경제적 교양과 액체에 적절하게 사용하실 수 있습니다. C.가 엘레간스 또한 약물 모드의 액션 3 신속하고 상세한 신분증을 허용 가장 실험적으로 다루기 쉬운 동물 모델 중 하나입니다.
우리는 culturing에 대한 프로토콜을 설명하고 C의 형광 변종을 분배 화학 라이브러리 또는 특정 유전자의 표현을 변경할 환경 오염 물질의 검출에 높은 처리량 검사 엘레간스. 발달 동기 웜의 큰 번호, 액체 문화에 재배 수확, 씻어, 그리고 정의 밀도에서 중단됩니다. 웜는 다음 연동 액체 디스펜서를 사용하여 검정, 평평한 바닥 384 잘 접시에 추가됩니다. 화학 라이브러리 또는 테스트 샘플 (예, 물, 음식, 또는 토양)에서 작은 분자는 벌레와 우물에 추가할 수 있습니다. 생체내에서 실시간 형광 강도가 형광 microplate 판독기로 측정됩니다. 이 방법은 C.에 inducible 유전자에 적용할 수 있습니다 적당한 기자 사용할 수있는 엘레간스. 많은 inducible의 스트레스와 발달 transcriptional 경로는 잘 C.에 정의되어 있습니다 엘레간스와 GFP 유전자 변형 기자의 종자는 이미 4 많은 존재합니다. 적절한 형질 기자와 함께하면, 우리의 방법은 경로의 모듈 레이터를위한 화면이나 환경 오염에 대한 강력한 바이오 센서 assays을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 C를 증명 엘레간스 문화와 분배 프로토콜은 HTS 분석과 함께 우리는 C를 모니터하기 위해 개발된 엘레간스 모자 'N'칼라 전사 인자 SKN - 1. SKN - 1과 포유류의 homologue의 Nrf2 5-10 산화 스트레스와 생체 이물 중 cytoprotective 유전자를 활성화해야합니다. Nrf2는 암, neurodegeneration, 그리고 만성 염증과 같은 다양한 연령과 관련된 질환에서 포유류를 보호하고 주요 chemotherapeutic 대상 11-13되고있다. 우리의 분석은 -4 SKN - 1 대상 유전자 GST 14 GFP 유전자 변형 기자를 기반으로, 이것은 글루타티온 - S transferase 6 인코딩합니다. GST -4 기자도 SKN - 1을 활성화 및 아크릴 아미드와 메틸 수은과 같은 오염 물질의 15-16 낮은 수준을 감지하는 데 사용할 수있는 생체 이물 및 산화 화학 바이오 센서이다.
프로토콜
1. 박테리아 웜 음식 준비
1 일
- 포화 E. 5 ML 추가 대장균 박테리아 OP50 문화 500 ML 끝내주는 국물은 50 μg / ML 스트렙토 마이신과 보충 37에 떨고 인큐베이터 (225 RPM) 숙박 성장 ° C.
날 2
- 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에서 만 50 ML 튜브 및 원심 분리기 박테리아에 하루 박테리아 문화를 분할.
- LB의 국물에서 가만히 따르다 액체 선충류의 성장 미디어 (NGM)의 10 ML 각 박테리아 펠렛을 resuspend. 박테리아를 resuspend 15 분 동안 바닥 통에 수평으로 흔들어. NGM 버퍼를 만들려면, 1 패 탈이온수 및 압력솥에 3g NaCl를 추가합니다. 55 쿨 ° C 및 주문에 다음 멸균 솔루션을 추가 : 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 개 중 1 개 ML, 1 M의 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 25 ML 1 ML합니다.
- 20 분 동안 2,500 RCF에서 냉장 원심 분리기에 박테리아 문화를 원심 분리기.
- NGM 버퍼에....
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토론
우리는 culturing위한 방법을 제시하고 유전자 변형 nematodes 많은 숫자를 분배. culturing 벌레에 사용되는 장비는 분자 복제를 수행 실험실을위한 표준이며, 액체 처리 및 형광 장비 microplates 많은 숫자를 처리 실험실에 대한 표준입니다. 라이브 C. 다수의 분배의 다른 방법 엘레간스 장비 19 정렬 비싼 입자가 필요합니다. Pgst - 4 : GFP 분석은 뚜껑 'N'칼라 전사 요소의 작은 분자 변조기를위한 화면으로, 환경 및 식품 시료 14,16의 생체 이물 및 산화제 오염 물질을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 강력한 inducible 유전자 변형 GFP 기자는 경로 및 환경 자극 4 넓은 범위에서 사용할 수 있으며, 따라서 우리의 방법은 여러 경로의 개발 모듈 레이터에 적용되어야하며 오염 물질의 광범위한 스펙트럼을 감지합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
C. 엘레간스 transgenes은 Caenorhabditis 유전학 센터 (미네소타, 미네 아 폴리스 대학, MN)에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH R21 부여 KS로 NS0667678 - 01에 의해 지원되었다. 모든 저자는 수집, 분석 및 데이터 해석에 참가했습니다. CKL, KS 및 KPC는 원고를 작성하고 수정에 참여했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| LB의 수프 | 연구 제품 국제 주식 회사 | L24066 | |
| 끝내주는 국물 | 연구 제품 국제 주식 회사 | T15100 | |
| 시너지 ™ HT 멀티 모드 Microplate Reader를 | BioTek | 필터 : GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo 선택 디스펜서 | BioTek | ||
| 웜 분배 플라스크 | 남부 과학 주식 회사, 미캐노피, FL | 사용자는 (352) 284-2531를 조립 | |
| 384 microplates | 그라 이너 바이오 원 | 5678-1209 | |
| 통풍 씰링 테이프 | Nunc | 241205 | |
| (5 - 히드록시 - P - naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone은 DMSO에 녹아있다 |
| DMSO | 시그마 - 알드리치 | D - 5879 | |
| C. 엘레간스 형질 변형 | 저자의 연구실 | VP596 | Pgst - 4 : GFP 및 Pdop - 3 : RFP |
참고문헌
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we.....
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재인쇄 및 허가
