마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜 생체내에 척수 이미징이 설명되어 있습니다. 이 방법은 호흡 유발 움직임을 최소화하고 더 정렬 또는 후처리 다른 필요하지 원시 영상 자료를 생산하기 위해 척추 안정화 장치와 마취 처방을 결합한 제품입니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 특정 세포 타입 2-3가 크게 생체내 4-7의 수많은 조직의 생리와 병리 학적 과정을 우리의 지식을 넓혀이에 형광 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 생쥐 두 - 광자 현미경 하나를 사용하여 생체내 이미징에. 중추 신경계 (CNS)의 연구에서는 소설의 과다 등에 따라 뉴런, astrocytes, microglia로 세포의 행동에 대해 종종 예상치 못한 결과를 생산했다 두뇌의 생체내 이미징의 광범위한 응용 프로그램을 찾고있다 생리적 또는 병적인 상태 8-17. 그러나, 대부분 기술적인 합병증은 살아있는 마우스 척수 연구에서 생체내 이미징의의 구현을 제한합니다. 특히, 폐, 심장에 척수의 해부 가까이 이미징 살아있는 척수 도전 과제 만들어 상당한 운동 유물을 생성합니다. 우리는 척추를 안정화 호흡 유도 동작을 감소시키고 생체내에서 이미지를 마우스 척수를 두 광자 현미경의 사용을 촉진하여 척수 이미징의 고유의 한계를 극복 소설 방법을 개발했습니다. 이것은 호흡 유도 동작을 크게 감소 그 결과, 깊은 마취의 방법으로 사용자 정의 척추 안정화 장치를 결합하여 이루어진다. 이 비디오 프로토콜은 조직 부상을 유지하고 최소한으로 출혈하여 장시간 동안 안정적인 생리 조건 하에서 유지 수있는 살아있는 척수의 작은 영역을 노출하는 방법을 보여줍니다. 대표 원시 이미지는 고해상도의 생체내 자세히 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 인수했다. timelapse 시퀀스가 살아있는 마우스 척수에있는 microglial 프로세스의 역동적인 동작을 보여줍니다. 또한, 같은 Z - 프레임의 연속 스캔이 입증이 방법은 이미지 정렬 후 획득을 필요로하지 않는 이미지 및 / 또는 timelapse 영화 스택을 생성 달성할 수있는 뛰어난 안정성의. 마지막으로, 우리는 생체내에 지속적인 생리적 또는 병적인 프로세스 종단 연구 있으므로이 방법은 나중에 timepoints에서 척수의 동일한 영역을 다시 방문하고 reimage하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
프로토콜
1. 척추 안정화 장치를 구축
- Narishige STS - A 콤팩트 척수 클램프 및 Narishige MA - 6N 헤드 개최 어댑터를 주문.
- 사용자 정의 디자인과 척추와 꼬리가 고정되어있는 반면 동물의 머리가 지원 있도록 스테인레스 스틸베이스 플레이트는 정렬의 두 Narishige 부품을 개최합니다. 전체 장치가 일반적으로 인하 현미경 무대에서 현미경 렌즈 아래에 적합해야한다는 점에 유의하십시오.
2. 동물 수술
- 미리 열 현미경의 공기 가열 장치와 챔버 37에서 유지 ° C.
- 동물의 무게를 100 MG 케타민을 15 MG xylazine 및 무균 조건 하에서 0.9 % NaCl 용액에 희석 체중 kg 당 2.5 MG의 acepromazine을 사용하여 마취 혼합합니다.
- 마취 혼합 (KXA) intraperitoneally을 주입하여 동물을 마취. 정기 발가락 곤란은 전반에 걸쳐 깊은 마취를 보장하기 위해 수행되어야합니다실험. 시간별 또는 필요에 따라 절반 원래의 복용과 함께 보충.
- 수술을 수행하는 동안 열 지원을 제공하는 작은 동물 가열 패드를 사용합니다.
- 각막 탈수 및 손상을 방지하기 위해 눈 위....
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토론
방법은 여기서 설명하는 것은 허용에 대한 안정적이고 두 광자 현미경을 사용하여 anesthetized 생쥐의 척수에서 인구 밀도가 높은 형광 세포 구조의 생체내 이미징의 반복. 달성 안정성은 맞춤 제작 척추 안정화 장치와 호흡 유발 운동 유물을 감소 마취 처방의 결과입니다. 척추 안정화 장치는 마우스 본체 아래 호흡 공간을 허용하고 상용 척추 클램프 및 헤드 장착 부분 (그림 1)를 사용하여 만들 수 있습니다. 방법은 법으로서, 높은 재현성이고 지속적으로 광범위한 이미지 후처리 (Fig.2와 비디오 1)하지 않고 실험 분석에 사용할 수있는 원시 데이터를 생성합니다. 이 기술은 따라서 상용 형광 마우스 라인 (Figs. 1-3 및 비디오 1)의 풍부 세포 세포 상호 작용 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 인구 밀도가 높은 세포 구조지만,뿐만 아니라 문제를 해결할 수LSO는 빠른 속도로 세포 기능이나 반응 (비디오 1, 2)를 발생. 예를 들면, 그것은 양적 시간이 지남에 따라뿐만 아니라 거리 chemotac.......
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공개 사항
우리는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 국립 다중 경화증에 의해 지원되었다 부여 사회 적응 및 / 또는 Davalos 외., J Neurosci 방법에서 reprinted KA 피규어와 영화 DD와 NIH / NINDS 보조금 NS051470, NS052189 및 NS066361에 RG4595A1 / T. 2008 3월 30일, Elsevier의 허가를 169 (1) :1 - 7 2,008 저작권.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 에 희석 70 kDa, ACSF (3 % W / V) |
| 케타민을 HCL | Bionichepharma | NDC 번호 : 67457-001-10 | 주사용, 50mg/ml |
| Anased | 로이드 실험실 | 나다 번호 : 139-236 | Xylazine의 주사용, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | 나다 번호 : 117-531 | 주사용, 10mg/ml |
| 인공 눈물 연고 | 피닉스 제약 | NDC 번호 : 57319-760 - 25 | 윤활유 |
| Betadine | 어부 | 19-061617 | |
| 맥퍼슨 - Westcott 가위 | 세계 정밀 인 스트 루먼트 | 555500S | 곡선, 야기한 팁 가위 |
| 스트레이트 집게 | 세계 정밀 인 스트 루먼트 | 555047FT | 톱니 팁 포셉 |
| 작은 용기가 부식 | 파인 과학 도구 | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia, 화이자 주식 회사 | 믹서 밀 MM400 | |
| 컴팩트 척수 클램프 | Narishige | STS - A | |
| 머리 들고 어댑터 | Narishige | MA - 6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences 주식 회사 | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | 박스터 헬스케어 | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser 제약 주식 회사 | NDC 번호 : 12496 - 6757-1 | Buprenorphine, 주사용 |
| Baytril | 바이엘 | 나다 140-913 | Enrofloxacin, 항균 주사용 2.27 % (20ml) |
| 생리대 - 대형 | 파인 과학 도구 | 21060-10 |
참고문헌
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
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재인쇄 및 허가
