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방법 논문

생체내에 쥐 모델

13.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/2782

⸱

2011년 5월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Orthopaedics, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Diagnostic Radiology, University of Maryland School of Medicine

이 논문에서

요약

생체내에 동물 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 fibular 신경의 피하 위치 활용합니다. 속도, 근육 활성화의 타이밍, 및 모션의 아크는 미리 정해진 및 상용 소프트웨어를 사용하여 동기화됩니다. 포스트 부상 변경 감시 생체내에 MR 영상 / 분광법을 사용하여.

초록

근육 계통 의사에 의해 치료의 가장 일반적인 불만 사항 중 하나입니다. 근육 부상은 일반적으로 환자의 역사와 혼자 신체 검사에서 진단, 그러나 임상 프레 젠 테이션은 크게 근육 부상 또는 근육 질환, 근육 손상의 평가와 환자의 부상, 환자의 고통을 허용 등의 범위에 따라 달라질 수 일반적으로 이러한 움직임의 부드러움, 강도, 범위, 그리고 더 최근의, 이미징 연구와 같은 임상 증상, 제한. 이러한 혈청 크레아틴 키나제 수준과 같은 생물 학적 마커, 일반적으로 근육의 부상과 함께 고가이지만 자신의 수준은 항상 강제 생산의 손실 서로 관련이 없어요. 이것은 손상의 "직접적인 조치"를 제공하는 동물에서 histological 결과의도 사실이지만, 함수의 모든 손실 계정을하지 않습니다. 일부 주장했다고​​ 수축성 강제에있는 근육의 전반적인 건강의 가장 포괄적인 측정합니다. 근육 부상 biomechanical 조건에 따라 다양한 발생하는 임의의 이벤트이기 때문에, 공부하기가 어렵습니다. 여기, 우리는 생체내 동물 모델에서이 토크를 측정하고 신뢰할 수있는 근육 부상을 만들어 설명합니다. 우리는 또한 현장에서 고립된 근육의 힘을 측정을위한 모델을 설명합니다. 또한, 우리는 작은 동물 MRI 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 생체내 손상 모델 및 사시 토크 측정 인치

  1. 이러한 절차는 쥐 또는 마우스 7,17,18 사용할 수 있습니다. 시작하려면, 정밀 기화기를 (고양이 # 91103, 베트 장비, 병원, 플레즌턴 사용하여 흡입 마취 (~ 유도 챔버의 유도에 대한 isoflurane 4~5%은 다음 유지 보수를 위해 nosecone 통해 isoflurane 2 % ~) 아래에있는 동물 부정사를 배치 , CA). 건조에서 각막을 보호하기 위해 각각의 눈에 살균 안과 크림 (Paralube 베트 연고, PharmaDerm, Floham 공원, NJ) 적용됩니다. 절차 동안 동물은 새장 바깥쪽에 삽입 가열 램프를 사용하여 따뜻한 유지하고 항상 동물에서 적어도 6 인치 있었죠.
  2. 준비 머리카락을 제거하여하고 부드러운 조직이나 뼈로 시딩 피부 박테리아를 방지하기 위해 betadine 70 %의 알코올의 스크럽을 교대로 청소하여 피부. 깊은 힘줄 반사의 부족 (발 곤란에 대한 응답으로 발이 인출)에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 주사 바늘을 수동으로 장비 (마우스 25G 또는 27G)에 다리를 안정화하기 위해 근위 경골을 통해 배치됩니다. 바늘은 다리의 앞쪽에 구획을 입력해서는 안됩니다.
  3. 동물 부정사와 발가락도 제대로 직면있다 그러한 고정 위치에 바늘을 잠금. 맞춤 만든 장치는 바늘을 확보하고이를 통해 다리를 안정화하는 데 사용됩니다.
  4. 맞춤 가공 footplate (그림 1)에 사지의 다리를 놓으십시오. footplate의 축선은 스테퍼 모터 (모델 T8904, NMB 기술, 챗스워스, CA) 및 토크 센서에 첨부되어 (모델 QWFK - 8M, Sensotec, 콜럼버스, OH). 발이 초기 그림 1에서와 같이, 그래서 그것이 발목 부분의 경골에 직교되어 정렬해야합니다.
  5. 신경이 속에 비골의 목 근처 fibular 신경을 자극하는 transcutaneous 전극 (723742, 하버드 장치, 캠브리지, MA) 또는 피하 전극을 (J05 니들 전극 바늘, 36BTP, ㅁ 전극 공급, 길로이, CA)를 사용 표면 위치. 시각 기슭이 확보되기 전에 기라도 일련의 (쥐를위한 마우스와 1 MS 펄스에 대한 펄스 0.1 MS) 수행하여 격리 dorsiflexion을 확인합니다. 일단 발이 전압의 증가에 대응하기 트위치 진폭의 증가는 반대 근육 (plantarflexors) 동시에 자극을 받고 있지, 접착제 테이프로 footplate을 확인 보안입니다.
  6. 부상하기 전에, 그리고 다친 후에 선택한 시간 지점에서, dorsiflexors의 용량을 생산 최대한의 힘을는 "최대한 사시 토크"(근육의 길이 변화없이 토크)으로 기록됩니다. 토크 측정은 부상을 유발하는 데 사용되는 것과 동일한 장비에서 수행됩니다. 최대한 사시 토크를 녹화하기 전에, 펄스 진폭은 트위치의 긴장과 발목의 최적의 위치를​​ 최적화하도록 조정됩니다는 dorsiflexors의 다른 길이에 기라도를 제공에 의해 결정됩니다. dorsiflexors (휴식 길이, 일명 소호)의 최적의 길이를 결정하는 토크 앵글 곡선을 얻기 후에, 토크 주파수 플롯은 점차적으로 200 MS 펄스 트레인 동안 펄스의 주파수를 증가하여 얻을 수 있습니다. 최대한의 융합 파상풍의 수축은 90-100 Hz에서에서 일반적으로 얻을 수 있습니다. 세 별도의 기라도와 파상풍의 수축을 기록하고 자세한 분석을 위해 저장됩니다.
  7. 수축성 활성화, 발목 회전 발병 및 토크 데이터 수집을 동기화 (Labview 버전 8.5, 내쇼날 인스 트루먼, 오스틴, TX)에 상용 소프트웨어를 사용합니다. 컴퓨터 제어 모터가 동시에 따라서 길어 수축 (또한 근육의 부상의 원인이 "편심"수축,라고도 함)에 이르는, 발바닥 굴곡에 footplate 이동하면서 dorsiflexor 근육의 자극이 발생합니다. 특정 프로토콜의 조사에 의해 원하는 부상의 원하는 크기에 따라 달라집니다. 부상의 규모, 또는 조직 손상은 같은 각속도, 근육 활성화의 타이밍, 운동 범위, 그리고 길어 수축의 번호로 변수의 조작에 의해 조정할 수 있습니다.
  8. 상해를 유발하기 위해서, 운동의 범위 연장의 속도, 그리고 필요에 따라 자극의 타이밍을 변화, 최대한의 수축에 사시 길어 수축을 비교하십시오. 예를 들어, 최대한 사시 수축은 dorsiflexors에서 얻은 것입니다 200 MS 후에 그들은 대략적인 정상 운동 (900 ° / 초)를 선택한 속도로 길어 있습니다. 운동 길어 정도가 부상 14 획득에 중요한 요소하기 전에 우리가 이전에 그 정품 인증을 표시합니다. dorsiflexors에 의해 만들어진 토크의 대부분은 TA 11이며, 우리는 이전에 보여주이 근육 5,13-15에 부상이 모델은 결과 것을. TA는 길어 전역 자극 남아있다.
  9. 부상 후, 동물은 장치에서 제거됩니다. tibial 핀은제거, 다리가 다시 세척하고, 동물은 케이지에 반환 (37 ° C에서 온도 제어 난방 블록에 위치) 및 복구까지 모니터합니다. 동물이 깨어 및 모바일 때까지이 기다리고 있습니다. 동물 절차를 수행하는 동안 눈에 띄는 고통을 고통없고 길어 수축에 의해 유도된 부상 후 보행에 눈에 띄는 변화 (예 : lameness) 없습니다. 그러나, 적절한 방지 통증 치료 (- 수술 후 48 시간을위한 0.1 MG / kg 12 시간마다 buprenorphine 0.05) 이후 관리합니다.

2. 전체 근육 긴장의 현장 측정.

  1. 동물이 준비되고 1.3 섹션을 통해 1.1 위에 설명된대로 경골이 안정됩니다. 모든 장비는 적절한 보정을위한 사전 테스트에 적어도 30 분 켜져 있고 힘 변환기의 온도 표류을 최소화하기 위해.
  2. 발목에 피부를 절개하고 앞쪽에 정강뼈 앞쪽에 근육 (TA)의 힘줄이 끊어. 조심스럽게 힘줄 4.0 Ethicon 실크 비 흡수성 봉합사를 묶고) 제공된 S - 후크 (무게 = 0.1g), 모델 FT03, 그라스 악기, 워릭, RI를 통해 부하 세포에 vicryl 치료를 연결합니다. 또는 사용자 정의 클램프 (무게 = 0.5g)은 vicryl의 봉합 (그림 2)에 힘줄이 부착하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 로드 셀은 TA가 (출발지와 삽입 사이의 당기의 직선) 휴식 길이로 조정하고 적절하게 정렬된 수 있도록 micromanipulator (키테 속이는 사람, 세계 정밀 계측기 병원, 사라소타, 플로리다)에 장착됩니다. TA는 가열 램프에 의해와 광유에 의해 탈수에서 냉각로부터 보호됩니다. 로드 셀 (각 시험 전 보정)에서 신호 수집 소프트웨어 (PolyVIEW 버전 2.1, 그라스 악기 수집하여 저장하는 A / D 보드에 DC 앰프 (모델 P122, 그라스 악기, 워릭, RI)를 통해 공급 아르 , 워릭, RI).
  4. 부하 세포에 TA를 첨부 L 0을 결정하기 위해 다른 근육 길이의 단일 기라도 (1 MS의 사각형 펄스)이 적용됩니다. 캘리퍼스를 사용하여 측정 근육을 휴식 길이, tibial tuberosity과 myotendinous 교차점 사이의 거리로 정의됩니다. 이 길이에서 점차 힘이 주파수 관계를 구축하기 위해 펄스 진폭 다음 펄스 주파수를 높일 수 있습니다. maximally 융합 파상풍의 수축은 약 90 - 100Hz (0.1 MS 또는 1 MS 펄스로 구성된 300 MS 기차 기간)에서 얻어진다. 최대한의 수축성 활성화 (P 0) 유도하기 위해 TA을 활성화하기 위해 최대 자극 강도의 150 %를 사용합니다. 최대한 파상풍의 수축은 어떤 원하는 시점에 피로의 인덱스를 제공하고, P 0 비율로 반복적으로 수행하고 표현할 수있다.

3. 생체내 MR 이미징 및 / 또는 설치류 골격 근육의 분광 인치

모든 MRI와 MRS는 Bruker Biospin (빌레 리카, MA) Paravision 5.0 소프트웨어를 실행 12cm 기울기 삽입 (660 MT / M 최대 그라데이션, 4,570 T / M / s의 최대 슬루 속도)를 갖춘 7.0 테슬라 MR 시스템에 수행됩니다.

  1. 1.1 위에서 설명한대로 isoflurane 증발과 동물 anesthetized입니다. MR - 호환 작은 동물 모니터링 및 게이팅 시스템 (SA 인 스트 루먼트 주식 회사)가 호흡 속도와 체온을 모니터하는 데 사용됩니다. 마우스 본체 온도는 36-37 ° C 온수 순환 장치를 사용하여에서 관리하고 있습니다. 맞춤 만든 홀더는 무릎에서 도보로 자석의 구멍에 평행 두 다리 부정사 위치에 마우스를 위치로 사용됩니다. 4 채널 수신 전용 표면 코일은 공진기 72mm 선형 상반기 내에 배치됩니다. 공진기 코일은 조정 및 샘플 일치합니다.
  2. MR 이미징 : localizers 후 다음 MR 검사가 수행됩니다 : 다음 매개 변수와 함께 휴식 향상과 함께 T1 - 가중 신속한 수집 (희귀) : TE = 9.52 MS, TR = 1800, 에코 기차 길이 = 4에서 - 비행기 해상도 100x100의 μm의 그리고 슬라이스 두께 = 750 μm의. 듀얼 에코 PD/T2 희귀 : TE = 19.0/57.1 MS, TR = 5000 MS, 에코 열차의 길이 = 4에서 - 비행기 해상도 100x100의 μm의, 그리고 슬라이스 두께 = 750 μm의. B - 값 = 350 S / mm -2, TE = 26 MS, TR = 4500 MS에서 - 비행기 해상도 150x150 μm의, 그리고 슬라이스 두께 = 750 μm의 : 12 비 colinear 방향을 사용하여 스핀 에코 (SE) 확산 텐서 이미지 데이터 . 16 TES에게 ΔTE와 182.5 MS에 = 11.4 MS = 11.4 MS, TR = 10000 MS에서 - 비행기 해상도 150x150 μm의, 그리고 슬라이스 두께 = 750 μm의를 사용하여 멀티 슬라이스 다중 에코 (MSME) T2 파라메 트릭 매핑 데이터입니다.
  3. 이미지 처리 : 확산 텐서의 재건과 tractography가 TrackVis이 (의생명 이미징을위한 Martinos 센터, 매사 추세츠 종합 병원, 보스톤, MA)를 사용하여 수행됩니다 의미 확산 (MD), 부분 이방성 (FA) 이미지뿐만 아니라 tractography지도를 만들 수 있습니다. T2 매핑은 MAT로 작성된 사용자 정의 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다 LAB (Mathworks, 내틱, MA)는 표준 T2 신호 방정식 각 픽셀의 측정 데이터에 맞게 비선형 최소 제곱을 사용합니다. 관심 측정 지역은 TA 내에서 매개 변수 값을 평가하기 위해 수행됩니다.
  4. 상반기 분광법 : 자동 shimming은 TA에서 1 X 1 X 4mm 3 voxel에 수행됩니다. 포인트가 해결 분광법 (보도) 펄스 시퀀스 (TR / TE = 18분의 2,000 MS) 1,024 평균과 같은 voxel의 스펙트럼을 획득하는 데 사용됩니다. 데이터 수집은 각 다리에 34분 있습니다. 분광 데이터는 LCModel 패키지 16를 사용하여 처리됩니다. 31P 분광법 : 듀얼 튜닝 (1H, 31P) 표면 코일은 생체내 분광법 (이지스) 펄스 시퀀스에서 선택한 이미지를 사용하거나화된 분광 (단일 펄스 실험을 사용) 이외의 언어를 수행하는 데 사용됩니다.

4. 수확과 근육을 저장.

TAS는 실험의 끝에 후에 수확 무게, 액체 질소에 냉동 스냅, 그리고 -80 ° C.에 저장됩니다 이것은 생체내 실험에서 다음 시간에 언제든지 수행할 수 있습니다. 근육은이 터미널 절차이므로, 즉시 현장 실험의 후에 수확하고 있습니다. 자세한 형태학의 연구, 동물은 좌심실을 통해 관류를 통해 4 % paraformaldehyde로 고정됩니다.

5. 대표 결과입니다.

그림 3은 생체내 장치에의 쥐의 대표 데이터를 보여줍니다의 생체내 장치가 dorsiflexor 근육에 의해 생성된 최대한의 토크를 얻기 위해 사용됩니다. 또한 이러한 동일한 근육에 부상을 유발하는 데 사용됩니다. 발목 관절이 plantarflexion 약 20 ° (0 °로 간주 발목 부분의 경골에 직교 위치 발)에 배치되면 근육의 길이 - 긴장 관계로 인해 최대한의 사시 토크는 일반적으로 발생합니다. 최대한의 사시도 토크가 얻어진다 후, 도보로 나서 부상 프로토콜을 시작하는 위치에 삽입할 수 있습니다. 70 ° - 그림 3은 0 °에서 운동의 아크 30 반복의 부상 프로토콜을 나타냅니다. 사시 단계 (채워진 화살표)과 수축 유발 부상 프로토콜 동안 길어 단계 (오픈 화살표)에서 생성된 토크의 꾸준한 감소를합니다. 토크는 Nmm 단위로 기록하지만, 절대값은 동물의 크기와 상태 (예, 부상 근육, 근육 피로, 또는 동종 재조합에 의해 특정 단백질을 부족 근육)에 의존합니다.

그림 4는 현장 장치에의 쥐의 대표 데이터를 보여줍니다. 우리는 현장 장치에서 길어 수축을 포함하지 않고 대신에, 우리가 알고있는 길이에서 각 근육에 의해 생산되는 최대한의 긴장을 분리 적절히 정렬하고, 측정할 수 있습니다. 그림 4는 쥐 정강뼈 앞쪽에 근육에 피로 테스트가 진행되는 동안 발생하는 강제의 점진적 상실을 보여줍니다. 이 특정 예제에서, 타이타닉의 수축은 5 분 동안 매초마다 한 번 수행했다. 장력 (힘)은 일반적으로 뉴튼스 (또는 g)에 기록된 있지만, 토크 같은 절대값은 동물의 크기와 상태에 따라 달라집니다 있습니다. 근육 무게가 바로이 절차 후 얻은이기 때문에, 힘이 근육 교차 단면적에 ( "특정 힘")를 정상화 수 있습니다.

그림 5는 T1 - 가중과 T2 파라메 트릭 매핑으로 마우스의 생체내 이미징에의 대표 데이터 (A), 확산 텐서 영상 (B), 1 H 분광법 (C), 31 P 분광에서 3D tractography를 보여줍니다. 자세한 내용은 그림 전설에 제공됩니다.

그림 1
그림 1 : 생체내 장치에서 .* 부상을 생산하려면, 경골이 안정되고 발이 모터 구동 판에 첨부되어 있습니다. footplate은 발바닥 굴곡 (점선 화살표)에 다리를 강제로 동안 발목 dorsiflexors은 fibular 신경을 통해 자극하고 있습니다.
* 러버링 & 데 데인, 허가와 함께 사용 제이 Biomechanics 2005.

그림 2
그림 2 : 현장 기기의 부하 셀은 TA가 휴식 길이로 조정하고 X, Y, 및 Z 방향으로 적절하게 정렬된 수 있도록 micromanipulator에 마운트됩니다. TA의 말초 힘줄은 부하 세포에 붙어 있으며, 단일 기라도가 L 0을 결정하기 위해 다른 근육의 길이 유도하고 있습니다. 최대한 파상풍의 수축이 최대한의 수축성 활성화 (P 0) 확인할 수 얻을 수 있습니다. 최대한 파상풍의 긴장은 시간에 원하는 지점에 피로의 인덱스를 제공하고, P 0 비율로 반복적으로 수행하고 표현할 수있다.

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그림 3 : 쥐의 수축을 길어에서 토크의 생체내기구 대표 추적 녹음에서 토크에서 데이터입니다. 이 특정 예제에서, 근육은 900의 각속도에서 운동의 70 ° 아크를 통해 footplate에 의해 (오픈 화살표) 길어 전에 피크 사시 수축 (채워진 화살표)를 유도하기 위해 200 밀리초에 대한 자극했다 ° / s의

그림 4
그림 4 : 쥐를에 정강뼈 앞쪽에 근육 (TA)의 반복 자극하는 동안 최대한의 사시 파상풍의 긴장에있는 감소를 보여주는 현장 기기의 대표 데이터의 장력 데이터입니다. 이 예제에서는 TA는 최적의 길이 (L 0) 조정, 고립, 그리고 5 분 매초마다 한 번 200 MS 파상풍의 수축과 자극했다.

그림 5
그림 5 : 생체내 이미징에서 A : 이미지가 정강뼈 앞쪽에 근육 (TA)에서 T1 - T2 가중 및 파라메 트릭 매핑 가로 (축) 섹션을 보여줍니다. 점선 빨간색 상자가 증가 부상에서 T2 (왼쪽)를 증가 대 손상되지 않은 (오른쪽) 표시 TA를 둘러싼 B :.. 확산 텐서 영상 (DTI)의 대표적인 3D tractography C가 : 마우스 TA의 1 H 스펙트럼 쇼 여러 감지 지질 resonances; intramyocellular (IMCL)와 extramyocellular의 지질 (EMCL) 봉우리 사이의 차별이 방법을 사용하여 얻은 것입니다 D가 : 쥐 TA의 31 P MR 스펙트럼은 phosphocreatine (PCR), 무기 인산 (PI), 그리고 세를 보여줍니다. 5' - 삼인산 (ATP) 아데노신의 resonances (α, β, γ).

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토론

"근육 손상은"정의와 여러 가지 단위로 측정되었습니다. 구조 손상 histological 결과 6,9에 분명하지만, 동물 연구에 사용되는 포함 근육 부상을 평가하는 데 사용되는 생물 학적 마커의 많은 하나의 문제는, 그들은 일반적으로 강제의 상실과 상관 관계하지 않는 것이있다. 근육 손상은 종종 그것을 검사하는 데 사용되는 분석의 컨텍스트 내에서 정의됩니다 아무도 찾는이 부상 후 수축성의 변화에​​ 대한 계정이 없습니다. 전체 수축성 기능이 부상 마커의 존재에도 불구하고 계속 할 수 있기 때문에, 강제의 손실이 부상 3의 가장 유효한 측정되어야하고, 아마도 가장 관련성이 높은 수 있습니다.

발병률은 예측하기 어렵습니다 그리고 임상 프레 젠 테이션이 크게 차이가 임의의 이벤트로 그것은 인간의 근육 부상을 공부하기가 어렵습니다. 따라서 많은 근육 부상에 관한 데이터의 많은 변수를 통해 제어 및 부상 및 복구의 메커니즘을 연...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 메릴랜드에서 Translational 이미징 (C - 장식)과 자기 공명 연구 센터 (MRRC)에 대한 코어의 실험실 공간과 시설과 박사 라오 Gullapalli하고 다시 자신의 관대한 기부에 대한 박사, 로버트 블로흐에게 감사를 표합니다 기술 지원. 이 작품은 쟁 재단에서 JAR로 건강 (K01AR053235 및 1R01AR059179)의 국립 연구소에서와 근육질 영양 장애 협회 (# 4278)에서와 부여하여 RML에 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

(모든 장비가 footplate 제외 마우스 및 쥐에 대해 동일합니다)

  • 버드 값 라인 내각 (뉴어크, 06M4718)
  • 다기능 L / O USB - 6221M (내쇼날 인 스트 루먼트, 779808-01)
  • 스테퍼 모터 컨트롤러 (뉴어크, 16M4189)
  • 스테퍼 모터 (뉴어크, 16M4198)
  • (허니웰, Sensotec, DV - 05) 게이지 앰프 스트레인
  • 토크 센서 (허니웰, QWLC - 8M)
  • 풋 플레이트 및 안정화 장치 (사용자가 만든, 특허 출원중)

참고문헌

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