immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.
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방법 논문
Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning
이 논문에서
요약
초록
Corti의 포유류의 기관은 mechanosensory 머리 nonsensory 지원 세포의 높은 주문한 세포 모자이크입니다
(1,2에서 검토)이 세포 모자이크. 시각화는 종종 Corti의 기관 간 sectioned되어 있어야합니다. 특히, 그의 핵 세포와 관련하여 basally 있습니다 nonsensory 기둥과 Deiters '세포는, Corti의 오르간을 교차 sectioning없이 시각 수 없습니다. 그러나, 기둥 및 Deiters '세포의 미세 세포질 프로세스를 포함 Corti의 포유류의 기관의 섬세한 cytoarchitecture는, 표준 immunohistochemical 얼룩 기술과 호환되는 이러한 파라핀과 cryo - sectioning 같은 일상 histological 절차에 의해 보존하기가 어렵습니다.
난 여기 공촛점 현미경 다음 달팽이관 전체 마운트 이러한 vibratome 섹션 immunohistochemical 얼룩의 sectioning vibratome 구성된 단순하고 강력한 절차를 설명합니다. 이 절차는 마우스 사지 봉오리, zebrafish 굿, 간, 췌장, 그리고 마음 (선택한 예제 3-6 참조)를 포함하여 여러 기관의 immunhistochemical 분석 널리 사용되고 있습니다. 또한이 절차는 배아와 성인 생쥐 일곱 모두 Corti의 돌연변이 및 제어 장기 기둥 휴대폰 번호의 이미징 및 quantitificaton 모두 sucessful했다. 이 방법은 그러나, 현재 널리 Corti의 포유 동물 장기를 검사하는 데 사용되지 않습니다. Corti의 성인용 기관의 벌금 cytoarchitecture의 향상된 보존을 제공하고 다양한 세포 유형의 부량 수 있도록 모두이 절차에 대한 가능성을 설명합니다.
프로토콜
1. 내부의 귀를 분리 및 고정
- Corti의 장기에서 세포 patterning의 분석을 위해, 안락사가 적절하게 배아 또는 성인 개최.
- 막의 내이 (内耳)를 포함, 귀의 캡슐을 절개하다. 마우스에서, 이것은 쉽게 (E) 일 14.5 세 이상이있는 E0.5가 질 플러그가 발견했습니다되는 날이 배아에서 배아에서 할 수 있습니다. 귀의 캡슐의 절개는 정중선에서 잘린과 두개골의 개방에 의해 첫번째 수행됩니다. 각각의 귀를 (그림 1A) 노출 두뇌를 제거합니다. 내부 귀는 그대로 사용 포셉 (예 : 더몬트 # 5, 그림. 1B)를 했대 수 있습니다. 이미지 Corti 기관의 경우, 귀의 캡슐과 관련된 모든의 연결 및 결합 조직의주의 제거가 필요하지 않습니다.
- 4 부드러운 락을과 4 % paraformaldehyde에 집중 (PFA)에 의해 전체 내부 귀를 수정 ° C 1.8 ML 나사 덮인 NUNC Cryo - 튜브 튜브 또는 기타 적절한 크기의 용기에 하룻밤. PFA 솔루션이 필요 때까지 -20 ° C에 보관 ddH 2 0에서 신선한하여야한다.
- 그 다음날, 1X 인산 세 변화로 정착액을 씻어 호수 (PBS)를 버퍼. 처리를위한 준비까지 조직은 개월 일 최대 살균 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 성인 조....
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토론
immunohistochemistry와 공촛점 이미징 다음 vibratome sectioning의 절차는 최소한의 조직 손상 Corti의 기관의 시각화를위한 수 있습니다. 분명 vibratome 섹션에서 내부 지역에서 가져온 공촛점 이미지는 고정 아티팩트에 의해 제한됩니다 세포 형태 우수 보전을 보여줍니다. 이러한 기둥 세포의 세포질 확장 나누기로 가끔 세포 중단이 (표시되지 않음) 관찰 되었으나 vibratome 섹션의 두 컷 - 표면에 가까운 촬영 공촛점 이미지, 내부 지역의 이미지에서 자주 구별할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 간단하고, 주요 장비 아이템 - vibratome 기계 및 공촛점 현미경 - 일반적으로 대부분의 수사관으로 액세스할 수있는 공통 장비 아이템입니다. 또한,이 접근법은 Corti의 기관에서 특정 얼룩을 보여줍니다 모든 항체에 대해 사용할 수 있습니다. 사실,이 방법의 주요 한계는 항체의 특이성이며,이 프로토콜의 3 단계로 수정 주어진 항체가 특정 얼룩집니다 있도록해야 할 수도 있습니다. 요약, 난.......
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공개 사항
동물 실험 위스콘신 IACUC의 메디컬 칼리지에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
저자는 아가로 오스 비즈를 사용하여 섹션을 탑재하는 제안에 대한 공촛점 현미경 박사 지앤 장을위한 어린이 연구소 이미징 코어의 사용을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 DC010387 부여했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| Leica 블레이드 마이크로톰 진동 VT1000S | Leica | ||
| 자이스 혈구 LSM510 레이저 스캐닝 공촛점 현미경 | 자이스 혈구 | ||
| 학생 더몬트 # 5 포셉 | 파인 과학 도구 | 91150-20 | |
| UltraPure 낮은 녹는 포인트 아가로 오스 | Invitrogen | 16520-050 | |
| 필 - A - 웨이 포함 금형 | Polysciences | 18986 또는 18646A | |
| 소 혈청 알부민 | 잭슨 ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| 염소 혈청 | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| 알렉사 플루어 568 염소 안티 - 토끼 IgG | Invitrogen | A - 11036 | 1:1000 희석 |
| Vectashield | 벡터 실험실 | H - 1000 | |
| YO - PRO - 1 | Invitrogen | Y3603 | |
| 진공 그리스 | 어부 | S41718 | |
| Affi - 젤 블루 젤 | 바이오 래드 | 153-7301 |
참고문헌
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
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재인쇄 및 허가
