이 모든 마운트 현장에서 하이브리드 프로토콜은 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아의 유전자 발현 연구에 대한 재현 고품질의 결과를 보장 중요한 단계를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
현장 하이브리드 화의 전체 마운트는 배아의 유전자 발현 패턴을 형성하기위한 매우 유익한 방법이다. 현장 하이브리드 절차에는 긴 있으며, 기술적으로 통칭 최종 결과의 질에 기여하는 여러 중요한 단계를 요구.이 프로토콜은 프로브 레이블과 성능을 최적화하기위한 세부 몇 가지 주요 품질 관리 단계에 대해 설명합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다 필요한 중요한 단계 중 reproducibly 고품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 첫째, 우리는 PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 체외 스크립트의를 통해 digoxygenin (파)이라는 RNA 프로브의 생성을 설명합니다. 우리는 양, 무결성 및 파 - 라벨 프로브의 특정 활동을 결정하는 세 가지 중요한 품질 관리 assays을 설명합니다. 이 단계는 전체 마우스 배아에서 내생 mRNAs를 감지하기에 충분한 감도의 프로브를 생성하기 위해 중요합니다.또한, 우리는 현장 하이브리드 화에 대한 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아의 고정 및 저장하는 방법을 설명합니다. 그런 다음, 우리는 하이브리드 조건, 사후 하이브리드 세차 및 비 특정 프로브 하이브 리다이 제이션을 제거하는 RNase 처리의 세부 정보가 rehydrated 배아의 제한 proteinase K는 소화에 대한 자세한 방법을 설명합니다. AP-복합 항체가 표시 프로브를 시각화하고 내생 성적표의 표현 패턴을 표시하는 데 사용됩니다. 대표 결과는 성공적인 실험과 일반 차선 실험에서 표시됩니다.
프로토콜
1. 체외 스크립트에 통해 Riboprobe 생성
- 체외 스크립트 템플릿에 대한 PCR 제품을 준비합니다.
- 자신의 5 '끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머.
참고 : 발기인 순서는 의미 - 스트랜드 PCR 프라이머의 5'end하는 의미 프로브를 인식에 사용됩니다 추가하고 발기인 순서는 안티센스 PCR 프라이머의 5'end에 추가는 안티 - 감지 프로브를 합성에 사용됩니다 1-3. 우리는 핵심 프로모터 시퀀스 대 핵심 프로모터 플러스 추가 5 '시퀀스가 포함 된 템플릿을 포함하는 템플릿 사이의 전사 효율에 차이를 발견하지 않았습니다. 이 메소드는 T3, T7과 SP6 파지의 추구와 함께 사용되었습니다.
그들은 비 특정 하이브리드와 thereb 될 수 있기 때문에 매우 유전자 가족이나 높은 반복적 인 시퀀스를 사이에 보존 아르 시퀀스은 피해야합니다y는 배경 착색을 향상시킬 수 있습니다. 높은 GC의 콘텐츠와 프로브는 T 잔류의 실행이 digoxigenin 분자 사이의 steric 간섭에 의한 발굴 - UTP의 설립을 제한과 제한 digoxigenin-rUTP 설립 및 DNA 템플릿 시퀀스를해야합니다. 프로브 길이는 300bp에서 1킬로....
- 자신의 5 '끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머.
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토론
이 프로토콜에 설명 된 방법은 다른 소스들로부터 적응 및 전체 마운트 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아에 최적화되어 있습니다. 척추 동물의 배아의 현장 하이브리드 화에 전체 마운트하기위한 방법은 먼저 1990 년대 초 2,5-12에 나타났다. 이 프로토콜은 주로 Xenopus의 배아 7,8뿐만 아니라 마우스 2,11 용으로 개발 된 방법에서 적응되었습니다. 우리 프로토콜에서 강조의 큰 거래는 프로브의주의 품질 평가에 배치됩니다. 높은 품질과 높은 특정 활동 RNA를 생성에 세심한주의가이 프로토콜에서 가장 오래된 단계에 의해 결정 프로브는 크게 데이터의 품질을 향상시키고 장기적으로 시간과 노력의 상당한 금액을 저장합니다. 우리 프로토콜은 파지 RNA 중합 효소의 전사에 대한 PCR 생성 된 DNA 템플릿의 사용을 포함한다. 이 방법은 신속하고 매우 확장 성이 있습니다. 이 RNA 프로브 강한 다수의의 생성을 활성화 할 수 있습니.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R21MH082360 (BGC)와 R01HD056315 (NRM)뿐만 아니라 조지아 대학에서 지원했다.
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재료
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참고문헌
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A.
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