우리의 실험은 HIV 양성 환자의 말초 혈액에서 translocating 세균 종의 시퀀싱 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
건강한 위장관은 생리학적으로 체액성 및 세포 점막 면역 시스템 1,2의 발전에 영향을 공생 미생물의 큰 다양성에 의해 식민지입니다.
Microbiota은 강한 점막 장벽을 통해 면역 시스템에서 격리됩니다. 감염 및 항생제는 정상적인 위장관의 장벽 가능한 면역 이상에 3 발생할 수 있습니다 상주 세균의 구성을 모두 변경하는 것으로 알려져 있습니다.
HIV는 면역 체계 활성화 4-7에 기여하는 등 lipopolysaccharide와 박테리아 DNA 조각과 같은 세균 bioproducts,의 체계 순환에 점막 면역 및 누설의 진보적인 장애와 위장 장애에 위반됩니다. 미생물 translocation은 HIV / AIDS immunopathogenesis 및 치료 4,8에 대한 응답으로 연관되어 있습니다.
우리는 HIV에 감염된 환자의 말초 혈액에 translocating 박테리아의 구성을 특징으로 목표. 우리의 목표를 추구하기 위해 우리는 시퀀싱 분석을 다음 panbacteric 16 ribosomial 유전자에 대해 PCR 반응을 설정합니다.
간단히, 모두 HIV에 감염된 건강한 과목에서 전체 혈액이 사용됩니다. 건강한 개인이 정상적인 창자 항상성을 제시 것을 감안할 때 microflora에 대한 translocation 이러한 환자에서 예상되지 않습니다. venipuncture와 플라즈마 분리하여 전체 혈액 컬렉션을 따라 DNA는 플라즈마에서 추출 및 유전자 9 ribosomial panbacteric 16에 대한 광범위한 PCR 반응을 수행하는 데 사용됩니다. 다음 PCR 제품 정화, 복제 및 시퀀싱 분석이 수행됩니다.
프로토콜
HIV에 감염된 혈액 샘플 처리가 중요한 권고 사항이 필요합니다.
혈액의 모든 표본은 강력한 누출 방지 용기에 이송해야합니다. 컨테이너의 외관 및 표본 함께 모든 서류의 오염을 방지하기 위해 표본을 수집시주의해야합니다.
감염된 혈액을 처리하는 모든 사람은 장갑을 착용해야합니다. 장갑이 변경 및 손을 표본 처리 완료 후 세탁해야합니다.
HIV에 감염된 혈액 샘플의 처리는 클래스 II 생물 학적 캐비닛 후드에서 수행되어야합니다.
기계 pipetting 보조를 사용해야합니다.
바늘이나 다른 샵스 (유리 예 : pipettes 또는 모세관 튜브 포함)의 사용은 아무런 대안이 없다는있는 경우로 제한되어야합니다.
실험실 표면은 혈액의 유출 후 적절한 화학 살균제로 소독해야하며 작업 활동을 완료하는 경우.
사용 오염된 물질은 재사용 전에 소독해야하거나 임상 폐기물 경로를 통해 정확하게 폐기해야합니다.
중재가 효과가 즉시 시작되어야합니다와 같은 잠재적으로 전염성이 혈액이나 체액 (즉, 이러한 요구하는 보편적인 예방 조치)에 직업 노출의 모든 사건은 응급으로 치료해야합니다.
프로토콜은 완성 오일이 필요합니다. 기간은 그림 1에 자세히 있습니다.
박테리아 종은 그림 2에서 설명한 방법을 사용 구분됩니다.
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토론
우리는 이에 HIV에 감염된 개인의 주변 혈액에 박테리아의 translocation을 특성화하기 위해 PCR / 시퀀싱 프로토콜을 보여줍니다.
대부분의 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 있습니다. 혈액 샘플링 후, 플라즈마는 haemolysis 및 DNA 조각 저하를 피하기 위해, 3분의 2 시간 이내에 원심 분리로 구분해야합니다. 샘플은 -80에서 다음 약 5 일 ° C.위한 -20 ° C에서 첫째 저장됩니다 박테리아 DNA의 손실이 발생할 수 있음을 여러 동결과 해동 사이클은 피해야한다.
플라즈마 샘플은 해동 후 12 시간 이내에 사용해야합니다.
최적화는 기증자 '말초 혈액에서 DNA의 최대 수량을 얻기 위해 수행되었다. 후자는 또.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 비디오 제작과 우수한 지원 밀라노 Scimone에 감사하고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| Easty - DNA 키트 | Invitrogen | K 180,001 | |
| 클로로포름 | 시그마 - 알드리치 | C2432 | |
| 에탄올 | 시그마 - 알드리치 | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| 라이 소 자임 | Fluka | 62,970 | 10 Distillated 물에 μg / ML |
| AmpliTaq 골드 | 응용 Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42,413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| 아가로 오스 | Eppendorf | C1343 | |
| DNA 사다리 | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR 마이크로 키트 | Invitrogen | K310050 | |
| LB 아가르, 분말 | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| 암피실린 | Invitrogen | 11593027 | 10 Distillated 물에 MG / ML |
| X - 여자 | Invitrogen | 15520034 | DMF에 40mg/mL |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | Distillated 물속에 100mM |
| 토포 TA 클로닝 키트 | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink 빠른 플라스미드 Miniprep 키트 | Invitrogen | K210010 | |
| 빅 염료 | 응용 Biosystem | 4,337,455 | |
| DyeEx 2.0 스핀 키트 | Qiagen | 63,204 |
참고문헌
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Na....
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