방법 논문

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

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DOI:

10.3791/2836

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2011년 7월 27일

 , 
1Neuroscience Graduate Group, University of Pennsylvania School of Medicine , 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania School of Medicine

이 논문에서

요약

여기에 플라스미드 overexpression 화면 설명 Saccharomyces cerevisiae 액체 처리 로봇과 못하였 느니라 플라스미드 라이브러리 및 높은 처리량 효모 변환 프로토콜을 사용합니다.

초록

신진 효모, Saccharomyces cerevisiae의는 인간의 질병에 직접 관련성이있는 사람 등 많은 중요한 세포 과정의 기본 메커니즘을 정의하는 강력한 모델 시스템입니다. 워낙 짧은 세대 시간과 잘 특징 게놈의 효모 모델 시스템의 주요 실험 이점은 주어진 과정에 관련된 유전자 및 경로를 식별하는 유전자 화면을 수행할 수있는 능력입니다. 지난 30 년 동안 같은 유전자 화면은 세포주기, 분비 경로와 진핵 세포 생물학 1-5의 많은 높은 보존 측면을 명료하게하다하는 데 사용되었습니다. 지난 몇 년 동안, 효모 종자와 plasmids 여러 genomewide 라이브러리는 60-10을 생성되었습니다. 이 컬렉션은 이제 이득과 손실 함수 접근법 11-16을 사용하여 유전자 기능의 체계적인 심문을 위해 수 있습니다. 여기 우리는 5500 효모 plasmids의 못하였 느니라 라이브러리를 사용하여 플라스미드 overexpression 화면을 수행하는 액체 처리 로봇과 높은 처리량 효모 변환 프로토콜의 사용에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 집합을 일으키는 인간 neurodegenerative 질병 단백질의 축적과 관련된 독성의 유전자 조절을 식별이 화면을 사용하고 있습니다. 여기에 제시 방법은 관심의 다른 세포 phenotypes의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 효모 변환을위한 준비

이 프로토콜은 열 96 - 웰 플레이트를 위해 설계되었습니다하지만, 이에 따라 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜은 변화 라운드 당보다 20 96 - 웰 플레이트에 대해 제대로 작동하지 않는 것으로 확인되었습니다. 전체 변환 절차 (단계 I.3에서) 약 여덟 시간이나 걸립니다.

  1. 나누어지는 Biorobot의 RapidPlate 액체 처리기와 함께 96 - 웰 플레이트 왕복 아래의 각 우물에 효모 ORF FLEXGene 라이브러리에서 플라스미드 DNA (μl / 100 NG)의 5 10μL. 장소 건조 하룻밤 클린 벤치 펌 모자 96 - 웰 플레이트를 발견. 우리는 센와 2μ 효모의 plasmids과 유사한 변환 효율성을 발견했다.
  2. 500mL 당황하게 Erlenmeyer 플라스크에서 쿼리 변형과 효모 펩톤 덱스 트로 오스 (YPD) 미디어 (10g / L 효모 추출물, 20g / L 펩톤, 20g / L의 포도당)의 200mL의 예방. (200 RPM) 흔들림 30 ° C에서 밤새 품어. 필요한 경우, 선택적 미디어 이러한 스타터 문화 사용할 수 있습니다.
  3. 다음날 아침, = 0.1 YPD의 2L에서 OD 600 쿼리 긴장을....

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토론

여기 우리는 효모에서 높은 처리량 플라스미드 overexpression 화면을 수행하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근 방식은 여러 세포 phenotypes의 유전자 조절에 대한 신속하고 불편 검사 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 연구원이 주 만에 효모 게놈의 상당 부분을 스크린 수 있습니다. 이러한 불편 접근법은 또한 이전의 연구 결과에 따라 예측되지 않았을 수 있습니다 수정자의 식별을 위해 수 있습니다. 우리는 인간의 neurodegenerative 질병 단백질 19,21-23의 집합과 관련된 독성의 수정자를 식별하는이 방법을 사용했습니다. 그러나, 때문에 다른 세포 프로세스를 연구하기 위해이 프로토콜의 적응성에,이 프로토콜은 중요한 생물 학적 질문 다양한 해결 연구자들에게 유용한 것입니다. 예를 들어, 우리는 중금속 및 산화 스트레스를 포함하여 환경 스트레스에 적응에 관련된 유전자 및 경로를 식별이 심사 방식 유용한 발견했다. 여기 하나의 플라스미드 도서관, 효모 FLEXGene 라이브러리

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 존스 홉킨스에​​서 ALS 연구 팩커드 센터 (ADG), NIH 원장의 새로운 이노 수상 1DP2OD004417 - 01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), 리타 앨런 재단 학술 상에서 교부금에 의해 지원되었다. ADG는 퓨 자선 트러스트가 지원하는 의생명 과학 퓨 학술 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
BioRobot RapidPlate Qiagen 9,000,490
96 볼트 레플리케이터 (frogger) V & P 과학 VP404
FLEXGene ORF 도서관 Proteomics 연구소, 하버드 메디컬 스쿨
테이블탑 원심 분리기 Eppendorf 5810R
500mL 플라스크 실패하는 Bellco 2543-00500
2.8L 트리플 당황하게 Fernbach 플라스크 Bellco 2551-02800
100μL Rapidplate 피펫 팁 Axygen ZT - 100 - RS
200μL Rapidplate 피펫 팁 Axygen ZT - 200 - RS

참고문헌

  1. Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
  2. Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
  3. Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R.

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재인쇄 및 허가

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태그

Saccharomyces Cerevisiae96

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