biarsenical 염료 플래시와 ReAsH 단백질의 tetracysteine 주제에 구체적으로 바인딩하고 선택적으로 살 세포에 단백질을 분류하실 수 있습니다. 최근에이 상표 전략은 다른 단백질 conformations 또는 oligomeric 상태에 대한 센서를 개발하는 데 사용되었습니다. 우리는 라벨 접근 방식을 설명하고 방법은 양적 바인딩을 분석합니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 단백질 및 염료는 세포에있는 단백질 밀매, 현지화 및 기능 연구에 필수적인 도구입니다. 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 단백질이 광범위 작은 태그는 같은 conformational 변화로 세포 검사로 단백질의 새로운 기능을 활성화와 관심 1 단백질의 속성, 최근 발전을 추적하는 단백질을 융합 파트너로 사용되었습니다 동안 그리고 단백질 협회 2, 3. 작은 태그 시스템은 유전자 biarsenical 염료에 바인딩 대상 단백질에 삽입 tetracysteine의 모티브 (CCXXCC)를 포함, ReAsH (적색 형광) 심지어이 살고 세포에 높은 특이성과 플래시 (녹색 형광). TC / biarsenical 염료 시스템은 conformational 변화와 단백질 - 단백질 상호 작용 4-7를 측정하는 여러 가지 새로운 방법을 사용할 수 있습니다 형광 단백질보다 호스트 단백질을 훨씬 덜 steric 제약을 제공합니다. 우리는 최근에 돌연변이 huntingtin을 표현하는 세포의 oligomerization의 센서로 TC 태그의 소설 응용 프로그램을 개발하는 헌팅턴 질병 7 뉴런에서 집계를 변이된 경우. Huntingtin은 두 개의 형광 염료, 하나 단백질 위치를 추적할 수있는 형광 단백질에만 단량체의 biarsenical 염료를 바인딩 두 번째 TC 태그 적었습니다. 따라서, 단백질과 biarsenical 염료 반응성 사이 colocalization의 변화는 공간 세포 내에서 매핑하는 submicroscopic 올리고머 컨텐츠를 활성화. 여기, 우리는 플래시 또는 ReAsH 라이브 포유 동물 세포와 방법을 두 가지 색상의 형광 (체리 / 플래시, CFP / / 플래시 또는 GFP를 수치와 형광 단백질 (체리, GFP 또는 CFP)로 융합 TC - 태그 단백질을 분류하는 방법에 대해 설명합니다 ReAsH 조합).
프로토콜
1. ReAsH / 플래시 라벨에 대한 세포의 준비
- 관심의 세포 라인에 대한 표준 세포 배양 방법을 사용하여 직접 transfection 준비 라이브 셀 이미징 슬라이드에 자기편 세포의 문화를 준비합니다.
- 선택의 transfection 방법에 따라 관심의 플라스미드가 포함된 TC - 태그 유전자를 Transfect.
TC 태그에 특정 바인딩의 범위를 평가하고 공촛점 micrographs를 수집하면 채널 사이에 형광 bleedthrough에 대한 평가에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, 두 색상 (예 : 플래시 / 체리 또는 ReAsH / CFP 또는 ReAsH / GFP 조합)에 대한 샘플은 단일 색상 (예 : 형광 단백질 혼자 또는 가능한 경우없이 형광등 플래시 / ReAsH 이에 바운드 TC - 태그 단백질에 대한 준비가되어 확인 단백질)
- 하나하는 데 이틀이 transfection 후 부드럽게 HBSS (37 ° C에서) 300 μL 사전 예열로 세포를 씻어.
- 부드럽게 prewarmed HBSS와 10 μm의 1,2 - ethanedithiol (동부 서머 타임) 300 μL 1 μm의 플래시 (또는....
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토론
두 번째 염료와 형광 단백질과 conformational 속성 레이블 단백질 지방화에 대한 접근 방법은 단백질의 다양한 conformations가 세포와 단백질 형태의 역학을 변경 이벤트에 발생한 위치를 매핑에 대한 많은 가능성을 제공합니다. ReAsH / 플래시 먼저 포유 동물 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질 I 4 단백질 접힘에 대한의 세포 센서로 사용되었다. 이 예제에서는 TC 태그에 바운드 플래시 제가 펼쳐 양식에 상대적으로 접힌 형태의 형광 수율 감소했다 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질로 설계하고, 접는는 E.으로 추적할 수 대장균 세포. 최근에는 단백질 접힘과 자기 협회는 bipartite tetracysteine 표시 6 모델 단백질에서 시연되었다. 이 예제에서는 모델 펩티드의 말초 dicysteine 쌍은 dicysteine 쌍을 포함하는이 펩티드의 결합시 또는 바인딩 biarsenical 염료에 대한 기능 tet.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 DMH와 TDM (NHMRC 프로젝트 보조금)에 부여로 투자했다. DMH는 미건야 트러스트에 의해 자금을 그림 웨이드 연구원입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| μ - 슬라이드 8 - 잘 | Ibidi | 80,826 | 우리는이 챔버는 이미징을위한 culturing 세포에 특히 유용하는 슬라이드 찾습니다. |
| TC - 플래시 II Tetracysteine 태그 감지 세포에서 키트 * 녹색 형광 * 살 세포 이미징 | Invitrogen | T34561 (플래시) 또는 T34562 (ReAsH) | |
| 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3 - Dimercapto -1 - 프로파놀 | 시그마 - 알드리치 | D1129 - 5ML | |
| 1,2 - Ethanedithiol | 시그마 - 알드리치 | 02390 - 25ML |
참고문헌
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C.
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재인쇄 및 허가
