우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
metagenomic 데이터의 성공적인 정확한 분석과 해석은 고품질, 높은 분자량 (HMW) 커뮤니티 DNA의 추출 효율에 의존적일 수 밖에 없습니다. 그러나, 환경 매트 샘플은 종종 높은 품질 HMW DNA의 큰 농도를 구하기 위해 어려움을 제기. Hypersaline의 미생물 매트 높은 세포외 고분자 물질의 양의 (EPS) 1 추출한 DNA의 다운 스트림 애플 리케이션을 억제 수 염분이 포함되어 있습니다. 직접적이고 거친 방법은 자주 내화물 샘플에서 DNA 추출에 사용됩니다. 매트, 접착제 매트릭스에 EPS 직접 용해하는 동안 DNA 2,3를 바인딩하기 때문에 이러한 방법은 일반적으로 사용됩니다. 엄격한 추출 방법의 결과로, DNA되고 작은 크기 4,5,6으로 조각.
DNA 따라서 대형 삽입 벡터 복제에 대한 부적 절한됩니다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 우리는 hypersaline 미생물 매트에서 좋은 품질과 수량의 HMW DNA를 추출하는 개선된 방법을보고합니다. 우리는 혼합 및 차동 원심 분리를 통해 배경 매트 매트릭스에서 미생물 세포의 분리와 관련된 간접적인 방법을 고용. 기계적 및 화학적 절차 조합이 추출된 미생물 세포에서 DNA를 추출하고 정화하는 데 사용되었다. 우리 프로토콜 1.6 280분의 260의 비율로, 매트 샘플 g 당 HMW DNA (35~50킬로바이트)의 약 2 μg을 산출. 또한, 16 rRNA 유전자 7 증폭이 프로토콜은 오염 물질의 억제 효과를 최소화하거나 제거할 수 있다고 제안합니다. 우리의 결과는 기능 metagenomic 연구 미생물 매트에서 HMW의 DNA의 추출을위한 적절한 방법을 제공하고 DNA 추출이 어려운있는에서 다른 환경 시료에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 미생물 세포 추출 :
- 철저하게 혼합하여 멸균 분쇄 유봉과 미생물 매트를 균질. 약 워링 믹서기의 멸균 용기에 무균 매트 재료의 모든 30g (서부 유럽 표준시 무게), 1 분 1 M NaCl (또는 사용 예제 특정 농도) 100 ML에 대한 추가하고, 중간 속도로 세 번 조화를 배치 1 분 -20 ° C의 냉동고에 간헐적으로 냉각. 250 ML의 원심 분리기 병에 슬러리를 전송하고 1 M NaCl과 함께 남아있는 빈 볼륨을 작성하십시오. autoclaved DI 워터의 NaCl 용액을 준비하고 소독 필터.
- 또한 30 분 실온에서 vortexer (소용돌이 - 지니 R 2)를 사용하여 (150 RPM) 흔들림으로 모체의 미생물 세포를 이동시키다.
- 4 15 분 ° C. 낮은 속도 (500x g)에서 원심 분리기 부드럽게 퇴적물에 최소한의 방해와 플라스크에 뜨는를 전송합니다.
- pelleted 퇴적물을 사용하면, 단계 1.3의 끝 부분에 각각의 퇴적물 펠렛 신선한 NaCl의 추가와 함께 1.2 1.3 4 개의 추가 시간을 혼합하여 단계를 반복합니다. 각 NaCl 추출에서 뜨는은 신선한 플라스크로 전송됩니다.
- 4 15 분에 대한 고속 (25,000 XG) 200 ML의 aliquots....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
복잡하고 매우 다양한 미생물 매트 샘플에서 전체 세포 제거 실용적 아니라는 것을 감안할 때, 기본 우려가 추출된 세포가 전체 미생물 매트 커뮤니티를 대표하는 얼마나 잘됩니다. 이전 연구에서는 미생물의 유전자 16 rRNA의 PCR - DGGE 분석이 프로토콜에 사용되는 다섯 셀 제거 단계를 전체 미생물 매트 커뮤니티 7 대표하는 세포를 추출 것으로 나타났다. 세포 추출의 실제 번호는 전체 미생물 커뮤니티의 대표적인 가능성이 샘플 종류에 의존 변화하는 세포 펠렛을 제공하는 데 필요한 단계를 반복합니다. 다른 샘플에 대한 최적의 프로토콜 개발을위한, 작은 규모의 파일럿 연구는 각 세포 추출 단계는 원래 지역 사회의 풍요로움에 비해 후 복구 미생물의 풍요로움의 경험적 테스트를 궁극적 권장합니다.
Fosmid 복제는 복제 라이브러리 건설 8 35-40킬로바이트의 HWM DNA가 필요합니다. 우리 프로토콜 35-50킬로바이트 (그림 4)에 이르기.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 환경 게놈 프로그램 (그랜트 번호 EF - 0723707)에 의해 재정 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| β - 메르 캅 토 에탄올 | 시그마 - 알드리치 | M3148 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 | Promega | V3011 | 1.2 M NaCl에 최고 20 % |
| 칼륨 아세테이트 | 피셔 사이 언티픽 | 피셔 사이 언티픽 | |
| 퀀트 - IT dsDNA 분석 키트 | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| 나트륨 염화물 | BDH 화학 | BDH8014 | 적절한 CONC. |
| 나트륨 Dodecyl의 황산 | 피셔 사이 언티픽 | 03-500-509 | 물에서 10 % |
| 나트륨 hexametaphosphate | EMD 화학 | SX0583 - 3 | 물에 2% |
| TBE | 피셔 사이 언티픽 | BP1333 - 1 | |
| 요리사 매퍼 XA 시스템 | 바이오 래드 연구소 | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 분광 광도계 | 써모 과학 | ND - 1000 | |
| Vortexer | 과학 산업 주식 회사 | ||
| 자외선 Crosslinker | UVP | ||
| 워링 믹서기 | 워링 실험실 | LB10S |
참고문헌
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steff....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
