우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 (VIGS) 분석에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 담배 래틀 바이러스 (TRV) - 파생 VIGS 벡터는 면화 GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 유전자의 입을 RNA를 유도하기 위해 배치되었다. 입을 GrCLA1로 인한 흰둥이 표현형은 접종 후 2 주 이내에 세들링 단계에서 관찰되었다.
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이 논문에서
요약
초록
커튼 (고십피움 히르수툼)는 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나입니다. 상당한 노력은 새로운 종류의 분자 육종에되었습니다. 면화의 대규모 유전자 기능 분석은 게놈, 유전자 복제 및 polyploidy, 유전자 변형 1 길이 성장주기와 말을 안들음 자사의 대형에 의한 가능성이 현대 식물 종, 대부분의 뒤에서 느껴지되었습니다. 커튼 높은 처리량 기능 유전자 / 게놈 연구를 촉진하기 위해, 우리는 면화 유전자 기능을 평가하기 위해 신속하고 효율적인 과도 assays을 개발하려고합니다.
바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS)은 바이러스 확산 2,3을 주체할 수있는 호스트 포스트 Transcriptional 진 입을 (PTGS)을 기반으로 개발된 강력한 기술입니다. Agrobacterium - 중재 VIGS가 성공적으로 같은 Solanaceae, Arabidopsis과 콩과의 식물 수종으로 dicots 종의 다양한 적용 및 monocots 수종 다양한 기능적 게놈 연구 3,4을 위해 보리, 밀 및 옥수수를 포함하고 있습니다. 이 신속하고 효율적인 접근법 식물 변환을 피할 수와 기능 중복을 극복로서, 그것은 특히 매력적이고 변화에 대한 의무가없는 목화 같은 작물 종의 기능 게놈 연구에 적합합니다.
본 연구에서는, 우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 VIGS 시스템의 상세한 프로토콜을보고합니다. 여러 바이러스 VIGS 벡터 중에서 담배 래틀 바이러스 (TRV)는 호스트의 다양한 침공하고 아직 hosts5에 가벼운 증상을 생산하여 전체 공장을 통해 적극적으로 전파 수 있습니다. 입을 효율, GrCLA1, alterados 1 면화의 유전자 (AtCLA1). CLA1 유전자가 엽록체 개발 6 관여 복제 및 VIGS 이진 벡터 pYL156에 삽입되었으며, 이전의 연구 보여주 Arabidopsis Cloroplastos의 상동체 유전자를 모니터링하는 것을 AtCLA1의 손실 기능은 효율을 입을 수있는 훌륭한 시각적인 마커를 제공하고, 진정한 나뭇잎 7 흰둥이 표현형 결과. 약 이주에 게시 Agrobacterium의 침투, 흰둥이 표현형은 모든 복제 실험에서 100 % 입을 효율, 진정한 나뭇잎에 표시하기 시작했습니다. 내생 유전자 표현의 입을는 RT - PCR 분석에 의해 확인되었다. 크게, 입을는 potently 텍사스 다양한 상업적으로 재배 품종을 포함하여 우리가 테스트한 모든 cultivars에 발생할 수 있습니다. 이것은 신속하고 효율적인 Agrobacterium - 중재 VIGS 분석은 목화의 게놈 - 넓은 수준에서 유전자 기능을 신속하게 대규모 분석을위한 매우 강력한 도구를 제공합니다.
프로토콜
1. 목화 모종의 성장
- 업랜드 커튼 (고십피움 히르수툼) 다양한 Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR 및 지하철 믹스 700 (SunGR, Beavile, WA)이있는 냄비 (지름 7cm)에 Deltapine 90 씨앗을 뿌리다.
- 23 플라스틱 돔 덮여 트레이에서 냄비를 유지 성장 방에 12시간 light/12 시간 어두운 photoperiod 함께 ° C, 120 μE m -2 S -1 빛.
- 이 cotyledons가 등장 돔을 제거합니다.
- 약 2 주후에 VIGS 분석의 두 가지 완전히 확장된 cotyledons과 식물을 사용합니다. 이 단계에서, 진정한 단풍은 아직 (그림 1) 등장하지 않았습니다.
2. GrCLA1 유전자를 운반 건설 VIGS 벡터
- G.의 cDNA 라이브러리에서 primers GrCLA1 - F와 PCR, 5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3 '와 GrCLA1 - R, 5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'로 무명의 Cloroplastos altera....
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토론
VIGS은 transiently 내생 유전자의 표현을 쓰러뜨린하여 기능적 게놈 분석에 강력한 도구로 입증되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 TRV 기반 이진 벡터를 이용하여 Agrobacterium - 중재 VIGS을 개발했습니다. 커튼 CLA1 (GrCLA1) 유전자는 입을 효율성을 모니터링하는 시각 마커로 개발되었습니다. 우리는 지속적으로 모든 종류의 진정한 나뭇잎에 나타나는 흰둥이 표현형은 약 2 주 게시물 침투로부터 시작, 테스트에 의해 입증 유전자 입을 효율의 100 %를 획득했습니다. 그러나, CLA1 - 침묵 면화 공장 거의 가능성이 엽록체 개발에 강한 결함에 의한 섬유 또는 종자 단계로 발전하지 않습니다. 목화 VIGS의 성공적인 개발은 쉽게 손실 기능 assays에 대한 관심의 유전자를 침묵하는 대안을 제공하고 빠르게 다가오고 포스트 게놈 시대 8 면화 기능 유전학 / 유전체학에 대한 기초를 낳는다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 DRS에게 감사하고 있습니다. SP Dinesh - 쿠마과 율 리우 TRV - VIGS 벡터, 그리고 DRS. 척 Kenerley, 테리 휠러, 짐 스타와 무명의 씨앗을 제공 바이엘 CropScience. 이 작품은 PH에 LS와 NIH에 NSF에 의해 투자되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 및 장비의 이름 | 회사 | 카탈로그 / 일련 번호 | 댓글 |
| 롤러 드럼 | 글라스 - 콜, LLC. | 099A TC108 | 농업 세균 문화 |
| 보육기 | 셸던 제조 주식 회사 | 01046209 | 농업 세균 문화 |
| UV / 비스 분광 광도계 | 베크맨 쿨터 | 모델 : DU530 | 측정 OD |
| 진 Pulser | BioRad | 모델 : 1652076; 직렬 : 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser 컨트롤러 | BioRad | 모델 : 1652098; 직렬 : 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation 쿠베트 | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ML 주사기 | BD Biosciences | 30,962 | 농업 세균의 접종 |
| 메트로 믹스 700 | SUNGR | SKU # 553001 | 성장 세들링 |
| 테라 코타 냄비 | TOPlastics | GPS 3001B2 | 성장 세들링 |
| MES 일수화물 | USB | 18,886 | 침투 버퍼 |
| Acetosyringone | 시그마 | D134406 | 침투 버퍼 |
참고문헌
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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