방법은 hypoxia - 국소 빈혈 신생아의 생화 학적 마커를 측정하는 설명되어 있습니다. 접근 방식은 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)와 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GC / MS)를 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신생아 hypoxia의 국소 빈혈은 조직의 불충 분한 혈액 관류 또는 산소의 체계 부족이 특징입니다. 이 조건은 원인 / 1-3 신경 장해를 포함하여 잘 문서화 신생아 장애를 증명했다 생각합니다. 아데노신 삼인산 감소 생산 산화 인산화 부족으로 인해 발생합니다. 고에너지 인산 채권을 포함하는 에너지 박탈 상태 분자 무마하기 위해 저하 이아르. 이것은 마침내 요산을, hypoxanthine, 크산텐을 이노신하기 위해 이후 타락 아데노신의 증가 수준에 이르게한다. 이 열화 과정의 마지막 두 단계는 크산텐의 산화 환원 효소에 의해 수행됩니다. 이 효소는 normoxic 조건 크산텐 탈수소 효소의 형태로 존재하지만 hypoxia - reperfusion 상황 4, 5 이하 크산텐 산화 효소 (XO)로 변환됩니다. 크산텐 탈수소 효소와는 달리, XO는 purine 저하 4, 6의 부산물로 과산화수소를 생성합니다. hypoxia 동안 생산 다른 반응 산소 종 (ROS)와 함께이 과산화수소가 알란토인을 형성 요산을 산화하고 malondialdehyde (MDA) 7-9을 생성하는 지질 세포막과 반응. 대부분의 포유류는 인간 면제, 어떤 효소 uricase을 가지고 알란토인에 요산을 변환합니다. 인간 그러나, 알란토인은 요산의 ROS - 매개 산화에 의해 형성 수 있습니다. 이 때문에, 알란토인은 uricase을 가진 포유류에없는 인간의 산화 스트레스 마커로 간주하지만,이다.
우리는 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 생화 학적 마커를 측정하는 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC), 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GCMS)를 고용하는 방법을 설명합니다. 인간의 혈액은 대부분의 테스트에 사용됩니다. uricase 생성 알란토인의 가능성을 인식하면서 동물의 혈액도 사용할 수 있습니다. Purine의 metabolites는 1963 빠르면 hypoxia와 hypoxanthine, 크산텐의 신뢰성에 연결되었고, 신생아 hypoxia의 생화 학적 지표로서 요산이 여러 조사에 의해 10-13 확인되었습니다. purine 화합물의 부량 사용 HPLC 방법은 빠르고 안정적이고 재현할 수 있습니다. 알란토인, 산화 스트레스의 새로운 마커의 부량 사용되는 GC / MS 방법, 지시 사항 외 7 적응했다. 이 방법은 특정 아티팩트를 방지하고 샘플의 낮은 볼륨을 필요로합니다. MMDA의 합성에 사용되는 방법은, 다른 14 15 설명했다. MDA의 GC / MS 기반 부량는 Paroni 외에서 적응했다. 그리고 Cighetti 외. 16, 17. 크산텐 산화 효소 활동이 isoxanthopterin 18 pterin의 전환 quantifying하여 HPLC로 측정되었다. 이러한 접근 방식은 충분히 민감하고 재현할 수이었다.
프로토콜
1. 샘플 수집 및 처리
- 얼음에 보관 6ml K3E EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) K3 튜브에 혈액 샘플을 수집합니다.
- 컬렉션 2 분 이내, 4에서 샘플을 원심 ° C, 10 분 1천5백g에서.
- 1.5ml microcentrifuge 관에 뜨는 (플라즈마)를 전송합니다.
- 30 분 18,000그램 4 ° C에서 원심 분리기.
- 뜨는 aliquots를 제거하고 purine (200μl), 알란토인 (50μl), MDA (100μl), 그리고 XO (120μl) 분석을위한 별도의 microcentrifuge 튜브로 그들을 전송합니다. 적혈구와 함께 샘플을 오염하지 않도록주의하십시오. 사용 가능한 플라즈마의 전체 부피에 따라 MDA, XO 및 purines에 대한 플라즈마의 볼륨을 조정해야 할 수도 있습니다.
2. Purine 및 XO 분석, 내부 표준, 2 Aminopurine (2 - AP) 준비
- 0.01351g 2 AP를 무게와 HCL 2-5 방울과 산성되었습니다 물 8ml에 추가합니다. 2 - AP가 해소되지 않을 경우 더 많은 마약을 추가해야합니다. 10ml에 마지막으로 볼륨을 조정합니다.
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토론
방법은 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 평가를 허용 여기에서 설명한. 이 프로토콜도 전반적인 생화 학적 존재의 사진이나 hypoxic 국소 빈혈의 정도를 얻기 위해 에너지 (ATP) 빈곤, 산화 스트레스, 산화 손상, 및 효소 활동의 마커의 측정을 결합한 제품입니다. 이 방법의 유용에도 불구하고, 잠재적인 제한이 있습니다. 첫째, 그것은 assays 모두 실행할 정도로 플라즈마를 수집하는 혈액의 약 1-2 ML 걸립니다. 이것은 성인이나 어린이 문제가되지 않습니다하지만, 특히 neonates, 조기 분들과 함께 작업할 때 그것이 우려된다. 우리는 assays에 우선 순위를하고 필요한 경우 샘플의 일부를 diluting하여이 문제를 해결 둘째, 그것이 MMDA를 합성하기 어려울 수 있습니다. 그러나, MDA는 내부 표준으로 MMDA를위한 대용품으로 사용할 수 있습니다 진정제를 맞았을.
이러한 제한에도 불구하고, 방법은 신생아 hypoxia의 국소 빈혈뿐만 아.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 R01 NR011209 - 03 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| 6ml K3E EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) K3 튜브 | 피셔 사이 언티픽 | 2,204,061 | |
| 5702R 원심 분리기 | 피셔 사이 언티픽 | 05413319 | 13 & 16MM 어댑터 |
| 1.5ml microcentrifuge 관 | 미국 과학 | 1615-5599 | |
| 2 Aminopurine | 시그마 - 알드리치 | A3509 | |
| 베리안 캐리 백 분광 광도계 | Agilant 기술 | 0010071500 | |
| 사반트 SpeedVac | 써모 과학 | SC210A - 115 | |
| 마이크론 원심 필터 장치 | 피셔 사이 언티픽 | UFC501596 | |
| Supelcosil LC - 18 - S 칼럼 | 시그마 - 알드리치 | 58,931 | |
| Supelcosil LC - 18 - S Supelguard 카트리지 및 홀더 | 시그마 - 알드리치 | 59,629 | |
| HPLC | 워터스 | ||
| GCMS 비알 | 피셔 사이 언티픽 | 03376607 | |
| DL - 알란토인 - 5 -13 C, 1 -15 N | CDN 동위 원소 | M - 2307 | 롯 # L340P9 |
| MTBSTFA | 써모 과학 | 48,920 | |
| 피리딘 | 시그마 - 알드리치 | 270970 | |
| 5973E GC / MSD | 애질런트 테크놀로지 스 | G7021A | 5975E GC / MS에 대한 # 부품 |
| 3 Ethoxymethacrolein | 시그마 - 알드리치 | 232548 | |
| 수산화 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | S5881 | |
| Dichloromethane | 시그마 - 알드리치 | 270997 | |
| 벤젠 | 시그마 - 알드리치 | 401765 | |
| Diisopropyl 에테르 | 시그마 - 알드리치 | 38,270 | |
| BHT | 시그마 - 알드리치 | B1378 | |
| 에탄올 | 시그마 - 알드리치 | 459844 | |
| Phenylhydrazine | 시그마 - 알드리치 | P26252 |
참고문헌
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M.
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재인쇄 및 허가
