Method Article

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

DOI:

10.3791/2969

⸱

October 26th, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

Abstract

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모델링 인간의 약물 독성의 진전에도 불구하고, 많은 화합물 unpredicted 부작용으로 인해 임상 실험 중에 실패합니다. 임상 연구의 비용은 실질적으로 있으며, 따라서 더 예측 독성학 화면은 개발 및 약물 개발 (Greenhough 외 2010) 초기에 배치되는 중요합니다. 인간 hepatocytes 약물 독성 평가에 대한 현재 황금 표준 모델을 대표하지만, 변수 함수를 전시 제한된 리소스입니다. 따라서, 불후의 세포 라인과 동물 조직 모델의 사용은 정기적으로 자신의 풍부한로 인해 고용하고 있습니다. 두 소스가 유익한 있지만, 그들은 가난한 기능, 종의 다양성 및 / 또는 문화에 불안정 (Dalgetty 외 2009)에 의해 제한됩니다. Pluripotent 줄기 세포 (PSCs)은 세포와 같은 인간 hepatocyte의 매력적인 대안 소스 (HLCs) (Medine 외 2010)입니다. PSCs 자기 갱신과 성인에있는 모든 체세포 유형 분화 수 있으며, 따라서 대표차별화된 세포의 가능성이 무진장 소스. 우리는 자동화 및 산출 기능 인간 HLCs (; 플레쳐 외 2008; Hannoun 외 2010; 페인 외 2011 헤이 헤이 외 2011 외 2008) 의무, 고효율, 간단하게 절차를 개발하였습니다. 우리는 우리의 기술은 약물 발견, 질병 모델링, 엑스트라 물질 장치의 건설과 가능성을 기반으로 세포 이식 요법에 대한 HLCs의 확장 생산으로 이어질 것이라 생각합니다.

Protocol

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1. 초기 모든 화학 주식 준비와 문화 plasticware의 코팅

모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.

  1. 인간의 기본적인 Fibroblast의 성장 인자 (hbFGF)의 준비
    1. 0.22 μm의 필터를 통해 PBS 및 필터에서 10 % BSA 솔루션을 준비합니다.
    2. 10 % BSA 용액에서 0.2 % BSA 솔루션을 준비합니다.
    3. 10 ML 0.2 % BSA solution/100의 μg의 hbFGF을 추가합니다.
    4. 사전 서부 유럽 표준시 0.22 μm의 필터를 통해 5 ML 10 % BSA 솔루션을 필터링하여 필터링합니다. 10 ML BSA 씻어 폐기하십시오.
    5. 미리 씻은 필터를 통해 hbFGF을 필터링합니다.
    6. -20 ° C.에 살균 eppendorfs 및 저장소에 나누어지는 hbFGF
  2. 인간 Activin 증권 솔루션에게의 준비
    1. 주사기 및 서부 유럽 표준시 미리 필터에 0.2 % BSA 1 ML을 추가합니다.
    2. 100 μg / ML의 재고 농도 0.2 % BSA에 Activin을 희석.
    3. Activi를 필터링N 무균 ....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간의 HLCs의 확장 수준을 생성하는 간단한 균일한 및 체외에서 높은 재현성 모델을 개발했습니다. 우리의 모델은 외부 협력 연구소들에 의해 검증되었습니다. 우리는 일상적으로 발달 마커와 간 특정 기능 assays (대부분의 상업 사용할 수있는)의 집 도구 상자에서 우리를 사용하여 줄기 세포 파생 HLCs을 특징. 우리 과정에서 중요한 단계는 다음과 같습니다 pluripotency 줄기 세포의 유지 보수, 최종 endoderm에 줄기 세포 분화를 직접하는 기능, 간장 endoderm의 균질 문화의 사양과 능력은 체외에서 광범위한 기능을 전시 성숙 간장 endoderm를 파생합니다.

HLC 기술을 파생 줄기 세포의 대규모 배포하는 한 제한은 문화의 성숙 간장 endoderm (matrigel에 ~ 4 일)의 단기 차별화된 기능을하고 있습니다. 이러한 이유로 우리는 폴리머를 가려 냈습니다바이오 활성화 및 새로운 세포 지원을위한 라이브러리입니.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박사 헤이가 RCUK 원정대에 의해 지원되었다, 박사 서쪽은 외과 부에 의해 지원되었다, 박사 Medine는 BHF 코어 기금에서 부여에 의해 지원되었다 씨, Baltasar Lucendo - Villarin은 MRC 박사 Studenship에 의해 지원되었다. 박사 만주국은 중국 정부의 장학금으로 지원했다.

....

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Materials

Matrigel 코팅 접시 flasks

  1. Matrigel (10 ML, BD Biosciences, 영국), -20 ° C.에 저장
  2. KO - DMEM (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  3. 조직 문화 플레이트 (물론 6 자 12, 코닝, 영국)
  4. 조직 문화 플라스크 (통풍 25cm2, 코닝, 영국)

hESC 유지 보수

  1. 마우스 배아 fibroblast 에어컨 매체 (MEF - CM) (100 ML, R & D 시스템, 미국), -20에 저장 ° C.
  2. BSA 용액 (50 ML, 시그마 알드리치, 영국), 4 저장 ° C.
  3. 인간 기본적인 fibroblast의 성장 인자 (100 μg, Peprotech, 미국), -20 ° C.에 저장

collagenase와 Passaging hESCs

  1. hESCs의 합류 잘 또는 술병.
  2. 적절하게 Matrigel 코팅 우물 또는 flasks.
  3. Phospate은 식염수 버퍼링 (- MgCl 2, CaCl - 2) (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 실온에서 보관합니다.
  4. Collagenase IV (1g, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  5. 마우스 배아 fibroblast 에어컨 매체 (MEF - CM) (100 ML, R & D 시스템, 미국).
  6. 인간 기본적인 fibroblast의 성장 인자 (100 μg, Peprotech, 미국).

간장 endoderm로 hESCs의 분화

  1. RPMI 1640 (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  2. B27 보충 (10 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), -20에 저장 ° C.
  3. Activin (2 μg, Peprotech, 미국), -20에 저장 ° C.
  4. 재조합 마우스 Wnt3a (2 μg, R & D 시스템, 미국), -20 ° C.에 저장
  5. KO - DMEM (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  6. KO - SR (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), -20 ° C.에 저장
  7. 비 필수 아미노산 (100 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  8. β - 메르 캅 토 에탄올 (10 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), 4 저장 ° C.
  9. DMSO (시그마 알드리치, 영국), 실온에서 보관
  10. Leibovitz L - 15 배지 (500 ML, Sigm올드 리치, 영국), 4 저장 ° C.
  11. Tryptose 인산 국물 (100 ML, 시그마 알드리치, 영국), 4 저장 ° C.
  12. Foetal 소 혈청, inactivated 열 (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), -20 ° C.에 저장
  13. 하이드로코티손 21 - hemisuccinate (100 MG, 시그마 알드리치, 영국), -20 ° C.에 저장
  14. 인슐린 (췌장 소) (100 MG, 시그마 알드리치, 영국), -20에 저장 ° C.
  15. L - 글루타민 (100 ML, Gibco, Invitrogen, 영국), -20 ° C.에 저장
  16. 아스코르비 산 (25g, 시그마 알드리치, 영국), -20에 저장 ° C.
  17. 인간 HGF (10 μg, Peprotech, 미국), -20 ° C.에 저장
  18. 재조합 인간 Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D 시스템, 미국), -20에 저장 ° C.
  19. 주사기 필터 유닛에게 0.22 μm의 (Millipore, 영국)을 구동

hESC 파생된 간장 Endoderm의 Characterisation

Immunostaining

  1. 인산 버퍼 염분 (- MgCl 2, CaCl - 2) (500 ML, Gibco, Invitrogen, 영국); sto상온에서 다시.
  2. PBST, PBS는 0.1 % 십대 초반 20 (시그마 - 올드 리치, 영국)와했다.
  3. Paraformaldehyde (PFA) (시그마 - 올드 리치, 영국)가 저장이 -20 ° C., PBS로 구성되어 있습니다
  4. 글리세롤 (시그마 - 올드 리치, 영국), 상온에서 저장합니다.
  5. 트리스베이스 (시그마 - 올드 리치, 영국), 상온에서 저장합니다.
  6. 에탄올
  7. 세럼 (AbD Serotech, 영국), -20 ° C.에 저장
  8. 차 항체, 알렉사의 Fluorophores (분자 프로브, Invitrogen, 영국).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc의 미국은) 당 제조 업체의 지시로 트리스 HCL과 글리세롤로 구성되어 있습니다. DAPI는 (피어스, 써모 피셔 과학, 영국) 1:1000 희석에 MOWIOL 솔루션에 추가됩니다.
List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
차 항체
항원 * 유형 공급 노동 희석
장백의 단클론 마우스 시그마 알드리치 5분의 100
E - Cadherin 단클론 마우스 Millipore 100분의 1
α - 페토 프로테인 단클론 마우스 시그마 500분의 1
SSEA - 4 FITC 단클론 마우스 Biolegend 100분의 1
IgG 단클론 마우스 DAKO 500분의 1
차 항체
안티 마우스 FITC 활용 단클론 염소 Invitrogen 4백분의 1

표 2. hESC 파생된 간장 endoderm의 immunostaining에 사용되는 항체의 농도가 사용, 그리고 기업 발전 종들은에서 구입한 수 있습니다.

간장 Endoderm 및 Normalisation의 기능 분석 (MG 단백질 당)

시토크롬 P450 Assays

  1. P4 - 글로 CYP3A4, CYP1A2, 키트 및 luminometer (Promega, 미국).
  2. 화이트 플랫 하단에 96 잘 분석 플레이트 (BD Biosciences, 영국).
  3. BCA 분석 키트 (피어스, 써모 피셔 과학, 영국).
  4. 투명 96 잘 분석 플레이트 (이와키, 영국)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D.

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