In vivo Murine Liver Perfusion: 문맥을 통해 설치류 간에 용액을 주입하는 방법

초록

출처: Cabral, F., et al. 마우스 간 관류에서 간세포 및 정현파 내피 세포의 정제. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 간 세포를 분리하기 전에 콜라겐 분해 효소 용액을 사용하여 문맥을 통한 마우스 간 관류 절차를 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

1. 용액 및 배양 배지 준비
   1. 재료표에 따라 모든 배양 배지와 완충액을 준비합니다.
2. 악기 준비
   1. 42°C에서 수조(>10L), 가변 속도의 연동 펌프, 플라스크를 고정하기 위한 클램프를 설정합니다. 구부러진 가위와 집게를 준비합니다(그림 1).
   2. 수조 위 또는 인접에서 스티로폼 패드(50mL 원추형 랙)가 있는 베이킹 시트(약 38 x 26cm)를 설정하고 20 x 20cm 조각으로 자른 흡수성 언더패드를 덮어씁니다(그림 1).
   3. 마스킹 테이프(5-8cm)를 근처에 놓습니다. 잘라서 사용할 준비가 된 20cm 폴리에스터 재봉실을 근처에 놓습니다. 접을 수 있는 바늘(7mm x 19mm, 그림 1)이 있는 플라스틱 카테터를 구합니다.
3. 유리 제품의 준비
   1. 클램프를 사용하여 용액에 1mL 피펫 2개가 들어가는 스토퍼와 함께 200mL의 1x PBS가 들어 있는 수조에 1L 플라스크를 놓고 고정합니다. 고무 코르크는 폐쇄 회로에서 유체의 재순환을 허용하기 위해 노치가 있습니다.
   2. 다른 클램프를 사용하여 45mL의 버퍼 2가 들어 있는 125mL 플라스크와 2개의 1mL 피펫이 있는 스토퍼를 놓는데, 그 중 하나는 플라스크 바닥 근처의 액체에 있고 다른 하나는 액체 위에 머물면서 플라스크에 산소를 불어넣습니다.
      메모: 스토퍼의 각 피펫에는 튜브를 쉽게 교체할 수 있도록 끝에 빠른 분리 어댑터가 부착되어 있습니다. 산소는 액체에 잠기지 않은 스토퍼의 피펫을 통해 두 플라스크로 부드럽게 흐를 것입니다.
   3. 두 개의 멸균 결정화 접시를 따로 보관하십시오.

2. 동물 절차

1. 수조에서 PBS 및 Buffer 2 용액을 42°C로 예열하고 폐쇄 회로의 튜브에서 PBS를 최소 20mL/분 동안 순환시켜 액체 라인을 따뜻하게 유지합니다. 여분의 튜브를 수조에 최대한 42°C에 가깝게 유지하도록 담그십시오. 튜브의 수 끝을 PBS가 들어 있는 1L 플라스크로 배수합니다.
2. 흡수성 언더패드에 면봉을 놓고 전사 피펫을 사용하여 면봉에 약 2mL의 30% 이소플루란(이소플루란의 증발 속도를 감소시키는 폴리에틸렌 글리콜 200으로 구성)을 추가합니다.
3. 꼬리를 잡고 결정화 접시 중 하나에 넣은 다음 접시를 면봉 위에 빠르게 뒤집어 쥐가 마취제를 흡입 할 수있는 작은 공간을 갖도록합니다. 마우스의 호흡 속도를 관찰하고 마우스가 효과적으로 마취 상태인지 확인합니다.
   메모: 호흡 속도는 더 느리고 깊어야 하며, 꼬리는 이완되어야 하며, 발은 마취 상태에서 핀치 테스트에 반응하지 않아야 합니다. 자세한 내용은 IACUC 지침을 참조하십시오.
4. 마우스가 마취되는 동안(1-2분 소요) 플런저를 당겨 작은 면봉을 삽입하여 10mL 주사기 배럴을 준비합니다. 전사 피펫을 사용하여 30% 이소플루란 1-2mL를 통 안의 면봉에 넣고 마우스가 의식을 잃을 때까지 기다리면서 배럴을 열린 쪽 끝으로 테이블 위에 놓습니다.
5. 결정화 접시를 빠르게 제거하고 마우스를 뒤로 뒤집고 주사기 배럴을 코 위에 놓습니다. 호흡 속도, 발가락 꼬집음 및 이완된 꼬리를 다시 확인하십시오. 발가락 꼬집음과 이완된 꼬리에 대한 모든 반응은 마우스가 완전히 마취되지 않았음을 나타냅니다. 의식 불명 상태를 유지하기 위해 주사기 배럴을 위에 두십시오.
6. 쥐의 발에 엄지 압정을 놓고 팔다리를 누운 자세로 뻗습니다. 복부와 흉곽을 70% 이소프로판올 또는 에탄올로 적십니다.
7. 한 손에 곧은 집게를 들고 복부 기저 부근의 피부를 들어 올립니다. 다른 손에는 가위를 들고 텐트가 있는 피부와 복막을 자릅니다. 절개 부위는 수평이어야 하거나 텐트가 있는 피부의 기저부를 가로질러야 합니다. 장에 접근할 수 있도록 피부와 복막의 모든 층을 잘라내야 합니다. 장기를 흠집내지 않고 복부 주위를 양쪽의 흉곽까지 옆으로 자릅니다.
8. 아래쪽 흉곽을 잘라 피부의 덮개를 잘라냅니다. 집게 뒤쪽으로 장을 오른쪽으로 움직여 문맥을 드러냅니다.
   메모: 동물의 출혈은 최소화되어야 합니다. 동물은 여전히 숨을 쉬고 있어야 하며 깊은 마취를 하고 있어야 합니다.
9. 간과 상췌장 십이지장 정맥 사이의 문맥 아래에 닫힌 곡선 겸자를 놓습니다(그림 2, 화살표).
10. 문맥 아래에 있는 집게를 엽니다. 실을 잡고 문맥 아래 중앙에 오도록 조심스럽게 당깁니다. 문맥을 조이지 않고 문맥 주위에 오버핸드 매듭을 묶습니다.
11. 구부러진 집게를 문맥 아래에 놓고 마우스 꼬리 쪽으로 부드럽게 당겨 정맥을 곧게 펴십시오(그림 3A).
12. 다른 한 손에는 카테터를 들고 바늘의 경사를 앞면이 위로 향하게 하고 집게 근처의 문맥 아래쪽 부분과 평행하게 놓습니다(그림 3B).
13. 바늘로 정맥을 부드럽게 뚫습니다(그림 3C). 바늘의 경사가 정맥의 내강에 있는지 확인하십시오. 스프링이 장착된 바늘을 집어넣고 베벨이 정맥 분지 부위 근처에 올 때까지 정맥을 통해 폴리머 카테터를 계속 밀어 넣습니다. 이것은 간 내에 있습니다. 카테터가 올바르게 삽입되면 혈액의 역류를 볼 수 있습니다. (그림 3D).
14. 오버핸드 매듭을 조이고 카테터에서 아래로 당기면 안정시키는 데 도움이 됩니다. 즉시 펌프 속도를 20mL/분에서 4mL/분으로 낮추고 배액을 위해 다른 주요 혈관을 절단합니다. 최적의 결과를 위해 복부 대동맥을 절단합니다.
15. 튜브의 수쪽 끝을 카테터의 암쪽 끝에 놓습니다(그림 4A). 라인에 기포가 없는지 확인하십시오. 카테터가 간 안으로 밀어 넣거나 정맥 밖으로 나오지 않도록 주의하십시오. 실의 배치는 정맥 밖으로 역류하는 것을 방지하고 카테터를 올바른 위치에 유지하는 데 도움이 되지만 반드시 필요한 것은 아닙니다(그림 4B, C).
16. 마스킹 테이프를 사용하여 튜브를 언더패드에 고정합니다. 곧은 집게를 사용하여 폐수 혈관을 짜서 간을 몇 번 팽창시켜 모든 혈액이 배출되었는지 확인합니다(그림 4D).
    메모: 표준 실험실 테이프가 작동하지 않을 수 있습니다. 그러나 마스킹 테이프는 젖은 상태에서도 언더패드에 붙어 있습니다.

3. 간 관류

1. 간이 PBS로 씻겨 나오는 동안 약 24mg의 콜라겐 분해 효소 IV형을 측정하고 수조에 버퍼 2 45mL가 들어 있는 플라스크에 넣습니다. 콜라겐 분해 효소가 완전히 용해되도록 플라스크의 액체를 휘젓고 플라스크를 클램프에 다시 넣어 플라스크의 액체를 포함하는 부분이 물에 완전히 잠기도록 합니다.
2. PBS로 씻겨 나갈 때 간의 색 변화를 관찰하십시오. 유출 튜브를 1L 플라스크에서 125mL 플라스크로 변경합니다. 기포가 간으로 유입되지 않도록 하십시오.
3. 관류 완충액이 간에 도달하면 삼출수 혈관을 짧게 꽉 쥐어 혈관 내에 약간의 압력을 형성하고 이 액체가 간의 모든 엽을 채우도록 합니다. 배액을 너무 오래 차단하면 간(글리슨 캡슐)을 둘러싼 얇은 결합 조직이 파열되어 간의 모세혈관 층 내에서 액체의 관류 또는 흐름이 파괴될 수 있으므로 배출을 너무 오래 차단하지 마십시오.
4. 콜라겐 분해 효소가 있는 버퍼 2가 45mL가 모두 조직을 통해 흐를 때까지 간을 통해 관류되도록 합니다.
   메모: 성공적일 경우, 글리송 캡슐은 실질 또는 간 조직에서 분리되어야 하며 간 자체는 비정질로 보여야 합니다.
5. 다른 결정화 접시에 약 10mL의 Buffer 1을 추가하고 마우스 옆에 놓습니다.
6. 카테터를 제거하고 펌프를 끕니다.
7. 곧은 집게와 가위로 쥐의 간을 잘라냅니다. 콜라겐분해효소 분해가 매우 효율적이라면 쥐에서 간을 퍼내어 완충액 1에 넣기 위해 깨끗하고 멸균된 숟가락이 필요할 수 있습니다.

결과

그림 1: 관류 제품군의 개략도. 플라스크는 클램프(표시되지 않음)로 제자리에 고정됩니다. 시술 중에 유체가 들어있는 튜브를 1L 플라스크에서 125mL 플라스크로 교체하는 것은 빨간색 점선으로 표시됩니다. 산소 공급은 플라스크의 용액으로 직접 거품이 발생하지 않습니다. 코르크는 또한 노치 내에 튜브가 삽입된 상태에서 폐쇄 회로 유체 흐름을 허용하기 위해 노치가 있어야 합니다. 이는 튜빙을 예열하는 동안과 튜빙 내의 모든 공기를 배출하는 데 중요합니다. 공기 배출은 Tygon 튜빙에 연결된 T-커넥터와 핀치 클램프로 구성되어 시스템을 빠르게 열고 닫을 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1L 삼각 플라스크	피셔 사이언티픽	S63274
250 mL 삼각 플라스크	피셔 사이언티픽	S63271
실리콘 튜빙	콜-파머	96400-14	이 튜브는 플라스크에서 펌프를 통해 T 커넥터로 이동한 다음 카테터에 연결된 1.0mL 주사기로 연결됩니다.
타이곤 튜빙	피셔 사이언티픽	R3603	96400-14 및 피펫 및 T 커넥터 사이의 어댑터로 사용됩니다.이것은 또한 산소 튜브에 사용될 수 있습니다.
T-커넥터	콜-파머	EW-06294-82
빠른 연결 해제	피셔 사이언티픽	우편번호 6150-0010
핀치 클램프	피셔 사이언티픽	우편번호 6165-0002
Masterflex L/S 가변 속도 펌프; 모델 7553-70	콜-파머	EW-07559-00	가변 속도의 감계 펌프
펌프 헤드, 모델 7014-20	콜-파머	EW-07014-20
유리 눈금이 매겨진 1.0 mL 피펫	피셔 사이언티픽	제13-678
곡선형이 아닌 톱니 모양의 가위	정밀 과학 도구	14069-12
Dumont 겸자	정밀 과학 도구	11252-20
곡선형 집게	정밀 과학 도구	13009-12
10mL 주사기	피셔 사이언티픽	03-377-23	주사기 한 통만 필요합니다
Sterlized 숟가락	가정용품점
면봉	가정용품점
폴리에스터 재봉실	가정용품점
마스킹 테이프	가정용품점
압정	가정용품점
스티로폼 패드	50 mL 코니컬 랙
쿠키/베이킹 시트	가정용품점
흡수성 언더패드	피셔 사이언티픽	14-206-64
19L 수조	피셔 사이언티픽	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd 차폐 IV 카테터 24 게이지	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	381412	개폐식 바늘이 있는 플라스틱 카테타르
접시 100x50 결정화	폭스바겐	89000-290
폴리스티렌 페트리 접시	시그마 알드리치	P5481-500개
50 mL 코니컬 튜브	피셔 사이언티픽	12-565-270
눈금이 매겨진 피펫(5 mL)	피셔 사이언티픽	170355
눈금이 매겨진 피펫(25 mL)	피셔 사이언티픽	170357
이지스트레이너 100 μM	그라이너 바이오 원	542000	100μm 필터
EasyStrainer 40 μM	그라이너 바이오 원	542040	40 μm 필터
시약
이름	화합물	그램 (g/L)	밀리몰(mM)
버퍼 1; pH 7.4	염화나트륨	8.3	142
	케이클	0.5	6.7
	헤페스	2.4	10
	증권 시세	15	0.226
버퍼 2; pH 7.4	염화나트륨	3.9	66.74
	케이클	0.5	6.71
	염화나트륨2	0.7	6.31
	헤페스	24	100
	증권 시세	15	0.226
	페놀 레드	0.01	0.03
PBS; 산도 7.4	염화나트륨	8	137
케이클	0.2	2.7
나2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0.2	1.4
다른 시약
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
콜라겐분해효소 IV형	시그마 알드리치	C5138
이소플루란	아브캠	AB144581

년 호 년 년 년 . 호 년 의 분 표시기 분 조 님 호 호 분 개 표시기 분 호 의 호