마우스 모델에서 Calvarial window generation: 마우스 두개골 상부에 창을 만드는 수술 절차

초록

출처: Geisler, J. A. et al. 두개내 주사 및 자기 공명 영상을 통한 뇌 전이 모델링. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 마우스 모델의 뇌에 접근하기 위한 종골 창을 만드는 수술 절차를 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술을 위한 정위 단위 준비

1. 모든 마취기, 디지털 버니어 저울 및 디지털 인젝터를 켭니다.
   메모: 모든 수술 도구는 수술 전에 적절하게 세척하고 멸균해야 합니다.
2. 생물 안전 캐비닛에 유도 챔버가 부착된 마취 기계를 사용합니다(그림 1A).
3. 마취 기계의 모든 튜브가 정위 프레임(그림 1B, 삽입 1C)에 연결되어 있고 clamp사용 중인 모든 장치에 대해 튜브의 s가 열려 있습니다. 모든 cl을 닫습니다.amp수술에 사용되지 않을 정위 프레임으로 가는 튜브의 s.
4. 마우스 무게에 따라 마취 기계를 제조업체에서 권장하는 노즈콘 유량으로 설정합니다(예: 동물 체중 25g: 노즈콘 유량 34mL/분).
   메모: 이 정위 설정에 포함된 헤드 홀더는 성인 마우스에만 권장됩니다. 정위 설정에 포함된 제조업체 권장 사항을 따르는지 확인하십시오.
5. 주사기에 미리 채워진 적절한 마취제(예: 이소플루란)가 마취기에 부착되어 있는지 확인합니다(그림 1B).
   메모: 주사기를 과도하게 프라이밍하면 수술 중에 너무 많은 마취제가 생쥐에게 전달되어 마취제 과다 투여를 초래할 수 있습니다.
6. 스테이지 잠금 장치를 비틀어 드릴을 준비하고 드릴 비트 어댑터와 1mm 드릴 비트를 각 드릴에 삽입하고 비트 잠금 장치를 수동으로 조여 드릴을 잠급니다.
7. 정위 프레임에 드릴을 부착합니다(그림 1C).

2. 입체 프레임에 마우스 배치

1. 앞서 언급한 유도 챔버를 사용하여 마우스(예: 이소플루란)를 마취합니다.
2. 시술 내내 깊은 마취 평면에서 마우스를 유지하십시오. 기계에 의해 투여되는 마취율은 유속, 자극 정도 및 체온을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 리듬 호흡을 평가하여 마취 깊이를 위해 절차 전반에 걸쳐 생쥐를 자주 모니터링합니다(동물이 헐떡거리지 않음). palpebral reflex(목화 팁 어플리케이터로 자극을 받았을 때 눈꺼풀이 떨림) 부족; 발가락 꼬집음의 부족 (발가락을 꼬집는 유해한 자극에 따라 팔다리가 빠지는 것).
   메모: 마우스의 다른 균주는 마취에 대한 다른 반응을 보일 것입니다.
3. 마우스가 적절하고 깊은 마취 평면에 있게 된 후, 마우스를 정위 유닛으로 옮깁니다. 마우스가 정위 기계에 있는 동안 가열 패드를 사용하여 체온과 적절한 마취면을 유지하십시오.
   메모: 로우 프로파일을 달성하기 위해 우리는 거꾸로 된 피펫 팁 상자(그림 1D의 마우스 올리기 상자) 내에 배치된 공기 작동식 손 난로를 사용합니다.
4. 마우스의 입을 열고 정위 프레임의 코 부분에 있는 입 막대의 홈에 이빨을 놓습니다(그림 2A). 노즈콘을 마우스의 코/입 위로 밉니다(그림 2B).
   1. 머리가 입 막대와 수평이 되도록 마우스를 놓습니다. 면봉 어플리케이터의 뭉툭한 끝으로 입을 부드럽게 벌리고 제자리에 밀어 넣습니다. 노즈콘이 마우스의 코 위에 완전히 있는지 확인하지 않으면 마취가 제대로 전달되지 않습니다. 콧방울은 치아가 이 홈 내에 안착되지 않으면 코와 맞물리지 않습니다(삽입 그림 2A).
5. 멸균 면봉을 사용하여 마우스의 각 눈에 눈 윤활제를 바릅니다. 안구 윤활제를 바르면 각막의 건조가 완화되고 각막 손상 및 각막 외상과 관련된 수술 후 합병증의 가능성이 줄어듭니다.
6. 왼쪽 귀 막대를 왼쪽 귀의 내측 안각에 대고 누르고 정위 프레임의 나사를 사용하여 제자리에 고정하여 마우스의 두개골을 안정화합니다. 그런 다음 오른쪽 이어바를 오른쪽 귀의 내측 안각에 대고 정위 프레임을 단단히 조입니다(그림 2B).
   메모: 이어바를 배치할 때 마우스의 머리가 수평이고 곧은지 확인하십시오. 머리가 비뚤어지거나 비스듬하면 뇌의 잘못된 위치에 주사가 놓이게 됩니다. 이어바는 적당한 수동 프로빙으로 자극을 받아 두개골이 움직이지 않을 때까지만 조여야 합니다.

3. Calvarial Window 만들기

1. 베타딘 용액과 70% 에탄올을 각각 3번 번갈아 가며 두피를 준비하고 청소합니다. 수술 부위가 눈과 매우 가깝기 때문에 수술용 스크럽 위에 베타딘 용액을 사용하십시오.
2. 멸균 메스를 사용하여 두개골의 중앙 정중면을 따라 피부를 통해 3mm 절개합니다(시상 봉합선을 따라). 절개 부위의 출혈은 최소화되어야 합니다. 출혈이 발생하면 멸균 면 팁 어플리케이터로 출혈 부위를 >30초 동안 일관되고 단단한 압력으로 가하십시오.
3. 브레그마에 수직으로 드릴을 식별하고 방향을 지정하고(그림 2C) 디지털 버니어 스케일을 0으로 재설정해야 합니다.
4. 드릴을 시상 봉합사 옆으로 2mm, 관상 봉합사 앞쪽으로 1mm 이동합니다(그림 2C). 재현성을 위해 시상 봉합선의 왼쪽 또는 오른쪽 위치가 모든 동물에 대해 일관되게 유지되는지 확인하십시오.
5. 드릴을 최대 속도로 돌립니다. 회전 비트로 인한 조직 손상을 방지하기 위해 피부가 드릴에서 멀어졌는지 확인하고 드릴을 두개골에 조심스럽게 시작합니다. calvaria를 통해 약 0.5mm 깊이의 구멍을 뚫어 calvarial window를 만듭니다. 드릴을 너무 많이 내리지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 드릴이 뇌에 구멍을 뚫을 수 있습니다. 드릴이 움직이는 동안 시추 부위에 멸균 식염수를 떨어뜨리면 주변 조직에 열 손상을 일으킬 수 있는 기계에서 발생하는 열을 상쇄할 수 있습니다.
6. calvarial window가 만들어지면 드릴을 조심스럽게 들어 올려 정위 프레임에서 제거합니다.
7. 70% 에탄올을 사용하여 드릴 비트를 청소하고 다시 사용할 경우 따로 보관하십시오. 그렇지 않은 경우 드릴 비트를 제거하고 70% 에탄올에 담그십시오.

결과

그림 1: 정위 및 마취 시스템.(A) 생물 안전 캐비닛 내에 설치된 마취 유도 챔버. (B) 마취 기계에서 정위 장치의 콧방울까지 마취 튜브를 강조하는 정위 마취 전달 설정((C)의 삽입 사진 참조). 녹색 화살표는 전달된 마취 가스 튜브를 나타내고 파란색 화살표는 소거된 가스 튜브를 나타냅니다. (C) 드릴 부착물이 있는 정위 스탠드. 삽입은 마취 튜브(녹색 및 파란색 화살표), 마우스 바 및 이어 바를 보여줍니다. (D) 자동 주사기 펌프와 마우스 승강 상자가 있는 정위 스탠드. 이 상자는 마우스를 적절한 높이로 올리고 체온을 유지하는 데 사용되는 손 난로가 들어 있는 거꾸로 된 피펫 팁 상자입니다. 삽입은 자동 주입 장치에서 Hamilton 주사기의 방향을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수술 재료
베타딘	퍼듀 제품	제19-027132	포비돈 요오드, 7.5%
뼈 왁스	외과 전문 분야	903	멸균 및 가단성 밀랍 및 이소프로필 팔미테이트
부포노핀 SR-Lab	주팜	해당 사항 없음	장기작용 주사제 5mL(0.5mg/mL) 폴리메트릭 제형
코튼 팁 어플리케이터	청교도	25-806 10WC	멸균 긴 줄기 코튼 팁 어플리케이터
눈 연고	푸랄루베	17033-211-38	윤활 바셀린 및 미네랄 오일 기반 안과 연고
핸드 워머	핫핸즈	HH2	공기 작동식 온팩
이부프로펜	위로 & 위로	TEL:094-01-0245	액체 현탁액에서 5mL당 100mg
이소플루란	헨리 샤인 INC	1182097	마취 기화기에 사용하기 위한 액체 마취제
메스	인테그라 밀텍스	4-410	#10 일회용 메스 블레이드
봉합 사	코비디엔	SP5686G	45cm 쐐기 형 5-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사
입체택시 단위
고속 드릴 (Foredom)	코프	모델 1474	최대 38,000RPM
마우스 가스 마취 헤드 홀더	코프	모델 923-B	이빨 구멍과 노즈콘이 있는 입 막대
Non-Rupture Ear Bars (파열 방지 이어바)	코프	모델 922	마우스 애플리케이션에 적합한 이어바
입체성 계기	코프	모델 940	베이스 플레이트, 프레임 및 리니어 스케일 어셈블리(디지털 판독 모니터 포함)
마취 기계
SomnoSuite 저유량 디지털 기화기	켄트 사이언티픽	친위대-01	디지털 마취기
마우스용 SomnoSuite 스타터 키트	켄트 사이언티픽	솜노-MSEKIT	인덕션 챔버, 마취 주사기 2개, 18인치 튜브, 플라스틱 노즈콘, 폐마취 가스통 2개 포함