미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

초록

출처: Hall-Roberts, H. et al. iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경모세포종 세포의 식세포작용을 위한 체외 정량 이미징 분석. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 신경모세포종에 대한 미세아교세포 형성 분석을 수행합니다. 이 분석은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 기능의 손상을 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. pH 민감성 적색 형광 염료를 사용한 Dead SH-SY5Ys 라벨링

1. 페놀 레드가 없는 HEPES 완충 배지에 부유하는 고정 SH-SY5Y 세포로 시작합니다. 세포를 세고 2mL의 저단백질 결합 튜브에 필요한 총 세포 수를 제거합니다. SH-SY5Y 100만 개당 페놀 레드가 없는 HEPES 완충 배지를 사용하여 2mL 튜브의 총 부피를 300–500μL로 구성합니다. 37°C의 수조에서 튜브를 잠시 따뜻하게 합니다.
2. pH에 민감한 적색 형광 염료 STP 에스테르(재료 표 참조)를 재구성하고 따뜻한 2mL 세포 튜브에 100만 SH-SY5Y당 12.5μg의 염료를 첨가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 튜브를 빛으로부터 보호하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: pH에 민감한 염료의 STP 에스테르 종은 1차 아민과 반응하므로 라벨링 버퍼에는 유리 아민이 포함되어서는 안 됩니다. 수성 완충액의 용해도가 제한될 수 있으므로 DMSO에 용해된 염료를 첨가하여 수성 완충액을 따뜻하게 하고 즉시 혼합한 다음 침전물(광학 현미경 하에서 어두운 입자)의 징후를 검사합니다.
3. HBSS 1mL를 넣고 1200 x g에서 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 HBSS 2mL로 세척합니다. 원심분리를 반복합니다.
4. 상등액을 버리고 페놀 레드가 없는 대식세포 배지(재료 표 참조)의 세포를 200,000–120만 cells/mL의 농도로 다시 현탁시켜 50 μL가 10,000–60,000 cells(즉, iPSC-대식세포보다 0.5x–3x 더 많은 SH-SY5Ys)가 되도록 합니다.
   메모: 배지의 페놀 레드는 배경 형광을 증가시키므로 라이브 셀 이미징을 수행해야 하는 경우 페놀 레드가 없는 배지를 사용해야 합니다. 얼룩진 SH-SY5Y를 몇 시간 이상 보관하는 것은 평가되지 않았으므로 권장하지 않습니다. 얼룩진 SH-SY5Y를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.

2. iPSC-대식세포의 염색

1. 생물 안전 작업대에서 짙은 적색 형광, 세포 투과성, 숙시니미딜 에스테르 반응성 염료의 대식세포 배지에 용액을 준비합니다(재료 표 참조). Hoechst 33342를 추가합니다(재료 표 참조). 수조에서 작업 용액을 37 ° C로 가열하십시오.
2. 다채널 피펫으로 세포 상층액을 멸균 저장소에 피펫팅하여 iPSC-대식세포 배지를 부드럽게 흡입합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 단계 2.1에서 준비한 염료 용액 70 μL/well을 iPSC-대식세포에 첨가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다.
3. phenol red-free 대식세포 배지에서 실험적 치료를 준비합니다. 10μM 사이토칼라신 D를 음성 대조군 치료제로 포함합니다. 배양 후 멀티채널 피펫으로 iPSC-대식세포 배지를 매우 부드럽게 흡인하고 100μL/웰의 Hank's buffered saline solution(HBSS)을 추가하여 세척합니다. 부드러운 피펫팅으로 HBSS를 즉시 제거한 다음 100μL의 배지 ± 화합물을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂.
   에서 10 분-1 시간 동안 배양 메모: 사이토칼라신 D는 강력한 액틴 억제제이며 식세포작용을 차단합니다. 더 긴 배양이 필요한 실험적 처리(예: 24–72시간)의 경우 전체 대식세포 배지에서 100μL/well의 처리를 사용하여 2.1단계 전에 실험적 처리를 수행합니다. 프로토콜에 따라 2.1–2.3단계를 수행하여 세포 염색을 수행한 후 나머지 식세포작용 분석을 위해 페놀 적색이 없는 대식세포 배지에 처리를 다시 적용합니다.

3. 이미징 식세포작용

1. 고정 세포 high-content imaging
   1. 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 라벨이 표시된 SH-SY5Ys 50μL를 추가하고 액체 가장자리의 각 웰 측면에 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 3-5 시간 동안 배양합니다.
   2. phagocytosis 배양 후, 멀티채널 피펫으로 피펫팅하여 세포 상층액을 부드럽게 흡인하고 폐기합니다. 100μL PBS로 한 번 세척합니다.
   3. 100μL의 2% 파라포름알데히드를 첨가하여 플레이트를 고정하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   4. 웰을 흡입하고 100μL의 PBS를 추가합니다. 플레이트 실러와 호일로 덮으십시오. 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
      메모: 분석 플레이트는 심각한 신호 저하 없이 최소 일주일 동안 이와 같이 보관할 수 있습니다. 더 긴 스토리지는 테스트되지 않았습니다.
   5. High-Content 이미징 현미경(재료 표 참조)을 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다. 화면 상단에 있는 Load 아이콘을 클릭하여 분석 플레이트를 현미경에 로드합니다.
   6. 설정 탭을 선택합니다. 왼쪽 상단 상자의 드롭다운 메뉴에서: 적절한 플레이트 유형을 선택하고, 자동 초점 옵션 Two Peak(기본값)를 선택하고, 대물렌즈 40x Water, NA1.1을 선택하고, 공초점 모드를 선택하고, 1의 비닝을 선택합니다.
   7. 사용하기 전에 설정 메뉴를 통해 40x 물 대물렌즈를 세척하십시오.
   8. 채널 선택 상자에서 + 아이콘을 사용하여 채널 DAPI, Alexa 647 및 Alexa 568을 추가합니다. 1μm의 단일 평면에서 측정하도록 설정합니다. 분석 플레이트의 염색 효율을 위해 시간 및 전력 설정을 최적화합니다.
      메모: 지침에 따라 DAPI를 200ms 노출 및 100% 전력으로, Alexa 647을 1500ms 노출 및 100% 전력으로, Alexa 568을 100ms 노출 및 40% 전력으로 설정합니다.
   9. Channel Sequence를 클릭하여 채널을 분리하여 채널이 동시에 측정되지 않는지 확인하십시오.
   10. Under Navigation(탐색) | 레이아웃을 정의하고, 측정 웰을 선택하고, 웰당 9–12개의 필드를 선택합니다.
   11. 설정하는 동안 플레이트 맵의 대표 필드를 클릭하고 각 측정 채널을 차례로 확인하여 채널 오프셋을 조정하여 염색이 존재하고 이미지의 초점이 맞춰졌는지 확인합니다.
   12. 원격 분석을 위해 데이터를 서버에 업로드하려면 온라인 작업 상자와 관련 화면 이름을 클릭합니다. 이렇게 하면 이미징 후 서버에 데이터를 자동으로 업로드할
   수 있습니다.
   13. Save 버튼을 클릭하여 분석 프로토콜을 저장합니다.
   14. 상단의 Run Experiment 탭을 클릭하고 실험 플레이트의 이름을 지정한 다음 Start를 클릭합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	송골매	352096	세포의 원심분리용
2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL 단일 채널 마이크로피펫
PBS 중 4% 파라포름알데히드	알파 에자르	J61899	세포의 정착을 위해
6-well plate, 조직 배양 처리
AggreWell-800 24웰 플레이트	스템셀 테크놀로지스	34815	배아체 형성을 위한 Microwell low-adherence 24-well plate
자동 세포 계수기
탁상용 원심분리기
탁상형 마이크로 원심분리기
CellCarrier-96 Ultra Microplates, 조직 배양 처리, 검정색, 96웰(뚜껑 포함	퍼킨 엘머	6055302	식세포작용 분석을 위해 검은색 웰 벽과 광학적으로 투명한 바닥이 있는 96웰 조직 배양(TC) 처리된 마이크로플레이트.
CellProfiler 소프트웨어			Live-cell Time-lapse microscope로 얻은 식세포작용 이미지를 분석하기 위한 오픈 소스 소프트웨어입니다. 웹 사이트 (http://cellprofiler.org/)에서 무료로 다운로드하는이 프로토콜은 버전 2.2.0을 사용했습니다.
CellTracker 딥 레드 염료	써모 피셔	C34565	iPS-대식세포의 세포질을 염색하기 위한 짙은 적색 형광, 세포 투과성, 숙시니미딜 에스테르 반응성 염료. CellTracker Deep Red 염료를 DMSO에 2mM(1.4mg/mL)로 용해시킵니다. 1 μM에서 대식세포 배지로 DMSO 스톡을 희석하여 사용합니다.
클래스 2 층류 공기 흐름 안전 캐비닛
CO2 가스통			EVOS FL Auto용 액세서리
CO2 인큐베이터, 37°C 및 5% CO2로 설정
사이토칼라신 D	케이맨	11330	phagocytosis 분석실험을 위한 음성 대조군 처리. DMSO에서 10mM로 재구성하고 -20°C에서 부분 표본을 보관하여 추가 동결-해동 주기를 방지합니다. 최종 농도 10μM에서 사용합니다.
DMEM/F12	지브코	11320074	SH-SY5Y 미디어의 구성 요소
디엠소	시그마	D8418	CellTracker 및 pHrodo 염료용 용매
소 태아 세럼	시그마	F4135	SH-SY5Y 미디어의 구성 요소
Geltrex LDEV-Free, hESC 인증, 성장 인자 감소 기저막 매트릭스	인비트로젠	A1413302	iPSC 배양을 위한 hESC 인증 기저막 매트릭스
글루타맥스 보충제	지브코	제35050-038	Factory 및 Macrophage 배지의 구성 요소
HBSS (하이브에스)	론자	10-547F가 되십시오	세척 단계를 위한 Hank's 균형 잡힌 소금 용액
인간 재조합 IL-3	지브코	PHC0033	Factory 및 Macrophage 배지의 구성 요소
Live Cell Imaging 솔루션	써모 피셔	A14291DJ	죽은 SH-SY5Ys 라벨링을 위한 페놀 무함유 HEPES 완충 배지
낮은 단백질 결합 2 mL 튜브	에펜도르프	제30108.132	SH-SY5Ys 염색용
M-CSF	써모 피셔	PHC9501	Factory 및 Macrophage 배지의 구성 요소
mTeSR1 미디엄	스템셀 테크놀로지스	85850	iPSC 배지
멀티채널 20-200 uL 파이펫			96웰 플레이트의 액체 핸들링용
NucBlue Live ReadyProbes 시약	써모 피셔	R37605	Hoechst 33342 제형을 iPS-대식세포의 핵 염색을 위한 스포이드 병에 담아 대식세포 배지에서 0.5방울/mL를 사용합니다.
Opera Phoenix High-Content 스크리닝 시스템	퍼킨 엘머	HH14000000	Harmony 소프트웨어 버전 4.9와 함께 사용되는 High-content imaging microscope.
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140-122	Factory, Macrophage 및 SH-SY5Y 배지의 구성 요소
pHrodo iFL 레드 STP-에스테르	써모 피셔	P36011	죽은 SH-SY5Ys를 라벨링하기 위한 pH에 민감한 적색 형광 염료. DMSO의 pHrodo iFL Red STP 에스테르 분말을 5mg/mL 농도로 재구성합니다. SH-SY5Y 100만 개당 2.5μL(12.5μg)의 pHrodo iFL Red STP Ester 스톡을 Live Cell Imaging Solution에 부유된 예열된 세포에 추가합니다.
혈청학적 피펫 필러
T175 플라스크, 조직 배양 처리			iPSC-대식세포 전구체의 분화를 위한 용기, "공장"으로 알려져 있습니다.
T75 플라스크			SH-SY5Y 배양용 용기
투명 플레이트 실러	Greiner 바이오 원	676001	분석 플레이트 보관 및 운송용
수조, 37°C로 설정
X-VIVO 15 배지 L-글루타민, 겐타마이신, 페놀 레드	론자	BE04-418F	Factory 및 Macrophage 배지의 구성 요소
X-VIVO 15 배지(L-글루타민 포함), 겐타마이신 또는 페놀 레드 없음	론자	04-744큐	Phenol red-free 대식세포 배지, 첨가제 또는 성장 인자 없이 phagocytosis에 사용

) 년 호 호 년 함유