신선 냉동 신경교종 조직에서 핵 분리: 신경교종 종양 샘플에서 온전한 핵을 얻는 방법

초록

출처: Narayanan, A. et al. 단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq에 대한 신선 냉동 뇌 종양에서 핵 분리. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 신선 동결 신경교종 조직에서 단핵을 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 분리된 단핵은 중추 신경 조직의 신경교종에서 관찰된 종양 간 및 종양 내 이질성에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 snRNA(single-nuclei RNA) 염기서열 분석 및 snATAC(Single-nuclei Assay for Transposase-Accessible Chromatin) 염기서열 분석과 같은 염기서열 분석 기술의 검체로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 조직 해부 및 해리

1. 신선한 냉동 조직 샘플(10–60mg)을 미리 식힌 페트리 접시에 옮깁니다. 면도날로 신선한 냉동 조직을 얼음 위의 작은 조각으로 다지거나 자릅니다.
2. 500μL의 냉각된 핵 용해 완충액을 사전 냉각된 1.5mL 튜브에 추가합니다. nuclei lysis buffer가 들어 있는 1.5mL 튜브에 조직 조각을 넣고 Douncer(Table of Materials)로 옮깁니다.
   메모: 두 개의 Dounce 균질화 유봉이 있습니다 : 초기 샘플 감소를위한 "느슨한"또는 "A"유봉과 완전한 샘플 균질화를위한 "단단한"또는 "B"유봉.
3. 마찰이 줄어들 때까지 "느슨한" 유봉으로 조직 조각을 약 20회 정도 두드립니다. 이물질이 있는 경우 100mm 스트레이너로 여과하여 샘플을 미리 세척할 수 있습니다.
4. 완전한 조직 균질화를 달성하기 위해 "단단한" 유봉으로 20회 스트로크합니다.
5. 균질액(약 500μL)을 예냉각된 2mL 튜브에 넣습니다. 냉각 용해 완충액 1mL를 추가합니다. 부드럽게 섞어 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 구멍이 넓은 피펫 팁으로 부드럽게 혼합하고 배양 중에 1-2회 반복합니다.
6. 30μm 스트레이너 메쉬를 사용하여 전체 균질액을 여과하고 15mL Falcon 튜브에 모은 다음 미리 냉각된 새 2mL 튜브로 다시 옮깁니다. 일반적으로 단일 스트레이너는 전체 균질화에 충분합니다.
7. 광학 현미경으로 큰 파편이 제거되고 핵막이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 핵은 둥글어야 하며 핵막이 뒤틀리지 않아야 합니다. 파편이 있는 경우 핵을 다시 여과할 수 있습니다.
8. 벤치탑 원심분리기에서 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 핵을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 핵이 포함된 펠릿과 함께 ~50 μL를 남깁니다. 펠릿을 다른 1mL의 핵 용해 완충액에 부드럽게 재현탁시키고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
9. 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 핵을 원심분리합니다.펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거하고 500mL의 1x 균질화 완충액(HB)(표 1)을 첨가하고 재부유 없이 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 1.0mL의 1x HB에 핵을 다시 현탁시킵니다.
10. 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 핵을 원심분리합니다.상등액을 제거하고 200μL의 1x HB에 있는 핵을 새 2.0mL 튜브에 부드럽게 재현탁합니다.

    표 1: 1x Homogenization Buffer 불안정 용액의 준비(샘플당 2mL)

    분 분 분 분 월

    1x 균질화 완충액 불안정 용액(샘플당 2mL)
    시약	파이널 콘크.	샘플당 부피(μL)
    6x 균질화 완충액 불안정	1배	333.33
    1 M 설탕	320 밀리미터미터	640.00
    50 mM 에다	0.1 밀리미터.	4.00
    10% NP40	0.1%	20시 00
    H2O		1006년 27

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-메르캅토에탄올	시그마	M6250
염화나트륨2	시그마	21115-100ML
EDTA (0.5 M)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	352096
MACS 스마트 스트레이너(100μm)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-098-463
마그네슘(Ac)2	시그마	63052-100ML
NP-40	아브캠	AB142227
Nuclei 분리 키트: Nuclei EZ Prep	시그마	NUC101-1KT
안전 잠금 튜브 1.5 mL	에펜도르프	30120086
안전 잠금 튜브 2.0 mL	에펜도르프	30120094
자당	시그마	S0389
광구경 피펫 팁(1000 μL)	테모 피셔 사이언티픽	2079GPK(영국 대표)

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