Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A technique to obtain extrapure fraction of intact nuclei using Density gradient centriugation(구배 원심분리 기반 핵 정제: 밀도 구배 원심분리를 사용하여 온전한 핵의 초순수 분획을 얻는 기술)

초록

출처: Narayanan, A. et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 그래디언트 원심분리를 사용하여 단일 핵을 분리하는 간단하고 효율적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 일단 분리되면 이러한 핵은 염기서열분석 및 게놈 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 그라디언 트 원심분리

1. 200μL의 50% 요오딕산올 용액(표 1)을 추가하여 25% 요오딕산올의 최종 농도를 얻습니다. 300mL에 설정된 피펫으로 10회 잘 섞습니다.
2. 25% 혼합물 아래에 300μL의 29% 요오딕산올 용액(표 2)을 추가합니다. 레이어가 혼합되지 않도록 P1000 미세 팁을 사용하십시오.
3. 29% 혼합물 하에 300μl의 35% 요오딕산올 용액(표 3)을 첨가합니다. 레이어가 혼합되지 않도록 P1000 미세 팁을 사용하십시오.
   주의: 이 단계에서는 과도한 부피 변위를 방지하기 위해 피펫팅 중에 피펫 팁을 점진적으로 제거해야 합니다.
4. 샘플을 스윙 버킷 원심 분리기에 넣고 브레이크를 끈 상태에서 4°C에서 3,500 x g로 20분 동안 회전합니다.
5. 흔들지 말고 샘플을 부드럽게 제거하고 빛 아래에서 관찰하십시오. 순도 95%의 핵으로 이루어진 투명한 흰색 띠가 두 번째 층과 세 번째 층 사이에서 보여야 합니다(그림 1).

2. 핵의 분리

1. 29%–35%의 계면에서 흰색 핵 띠가 될 때까지 맨 위 층을 흡인합니다.
2. 200mL 용량의 핵 밴드를 수집하고, 새 튜브로 옮긴 다음, 20μm 필터(Table of Materials)로 여과합니다(Table of Materials).
   메모: 여과 전에 핵을 재현탁할 필요가 없습니다.
3. 광학 현미경으로 큰 파편이 제거되고 핵막이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 핵은 둥글어야 하며 핵막이 뒤틀리지 않아야 합니다.
4. 혈구계의 Trypan blue 염색을 사용하여 핵을 계수하고 snRNA-seq/snATAC-seq에 대한 부분 표본 핵을 계산합니다.

표 1: 6x Homogenization Buffer Stable Master Mix 제조

호 조 .

6x 균질화 버퍼 안정 마스터 믹스
시약	파이널 콘크.	100 (mL)에 대한 Vol
1 M CaCl₂	30 밀리미터.	3.0
1M 마그네슘(Ac)₂	18 밀리미터.	1.8
1M 트리스 pH 7.8	60 밀리미터미터	6.0
H₂O		89.2
실온에서 보관하고 빛에 직접 노출되지 않도록 하십시오

표 2: 1M 자당의 제조

. .

1 M 설탕

자당 34.23 g

78.5mL의 물에 녹입니다

최대 100mL까지 물을 채웁니다

표 3: 6x Homogenization Buffer 불안정 용액의 준비(샘플당 650μL)

분 년

6x 균질화 완충액 불안정 용액(샘플당 650mL)
시약	파이널 콘크.	샘플당 부피(μL)
6x 균질화 버퍼 안정	6배	648.84
100mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)	0.1 밀리미터.	1.08
14.3M β-메르캅토에탄올	1 밀리엠	0.08

결과

그림 1: 핵 분리를 위한 순서도. 순서도는 신선하게 동결된 신경교종 조직에서 단일 핵을 분리하는 것과 관련된 단계에 대한 간략한 전망을 제공합니다. 종양 샘플과 요오딕산올/자당 구배(빨간색 점선으로 원으로 표시) 후의 핵 띠에 대한 대표 이미지가 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EDTA (0.5 M)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	352096
요오딕산올(일명 Optiprep)	줄기세포 기술	제07820
NP-40	아브캠	AB142227
안전 잠금 튜브 1.5 mL	에펜도르프	0030120086
안전 잠금 튜브 2.0 mL	에펜도르프	0030120094
자당	시그마	S0389
광구경 피펫 팁(1000 μL)	테모 피셔 사이언티픽	2079GPK(영국 대표)
광폭 피펫 팁(200 μL)	테모 피셔 사이언티픽	2069GPK(유엔 제외)

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