방법 논문

Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A technique to obtain extrapure fraction of intact nuclei using Density gradient centriugation(구배 원심분리 기반 핵 정제: 밀도 구배 원심분리를 사용하여 온전한 핵의 초순수 분획을 얻는 기술)

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Narayanan, A. et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 그래디언트 원심분리를 사용하여 단일 핵을 분리하는 간단하고 효율적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 일단 분리되면 이러한 핵은 염기서열분석 및 게놈 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 그라디언 트 원심분리

  1. 200μL의 50% 요오딕산올 용액(표 1)을 추가하여 25% 요오딕산올의 최종 농도를 얻습니다. 300mL에 설정된 피펫으로 10회 잘 섞습니다.
  2. 25% 혼합물 아래에 300μL의 29% 요오딕산올 용액(표 2)을 추가합니다. 레이어가 혼합되지 않도록 P1000 미세 팁을 사용하십시오.
  3. 29% 혼합물 하에 300μl의 35% 요오딕산올 용액(표 3)을 첨가합니다. 레이어가 혼합되지 않도록 P1000 미세 팁을 사용하십시오.
    주의: 이 단계에서는 과도한 부피 변위를 방지하기 위해 피펫팅 중에 피펫 팁을 점진적으로 제거해야 합니다.
  4. 샘플을 스윙 버킷 원심 분리기에 넣고 브레이크를 끈 상태에서 4°C에서 3,500 x g로 20분 동안 회전합니다.
  5. 흔들지 말고 샘플을 부드럽게 제거하고 빛 아래에서 관찰하십시오. 순도 95%의 핵으로 이루어진 투명한 흰색 띠가 두 번째 층과 세 번째 층 사이에서 보여야 합니다(그림 1).

2. 핵의 분리

  1. 29%–35%의 계면에서 흰색 핵 띠가 될 때까지 맨 위 층을 흡인합니다.
  2. 200mL 용량의 핵 밴드를 수집하고, 새 튜브로 옮긴 다음, 20μm 필터(Table of Materials)로 여과합니다(Table of Materials).
    메모: 여과 전에 핵을 재현탁할 필요가 없습니다.
  3. 광학 현미경으로 큰 파편이 제거되고 핵막이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 핵은 둥글어야 하며 핵막이 뒤틀리지 않아야 합니다.
  4. 혈구계의 Trypan blue 염색을 사용하여 핵을 계수하고 snRNA-seq/snATAC-seq에 대한 부분 표본 핵을 계산합니다.

표 1: 6x Homogenization Buffer Stable Master Mix 제조

호 조 .
6x 균질화 버퍼 안정 마스터 믹스
시약파이널 콘크.100 (mL)에 대한 Vol
1 M CaCl₂30 밀리미터.3.0
1M 마그네슘(Ac)₂18 밀리미터.1.8
1M 트리스 pH 7.860 밀리미터미터6.0
H₂O89.2
실온에서 보관하고 빛에 직접 노출되지 않도록 하십시오

표 2: 1M 자당의 제조

. .
1 M 설탕
자당 34.23 g
78.5mL의 물에 녹입니다
최대 100mL까지 물을 채웁니다

표 3: 6x Homogenization Buffer 불안정 용액의 준비(샘플당 650μL)

분 년
6x 균질화 완충액 불안정 용액(샘플당 650mL)
시약파이널 콘크.샘플당 부피(μL)
6x 균질화 버퍼 안정6배648.84
100mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)0.1 밀리미터.1.08
14.3M β-메르캅토에탄올1 밀리엠0.08

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결과

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figure-results-1
그림 1: 핵 분리를 위한 순서도. 순서도는 신선하게 동결된 신경교종 조직에서 단일 핵을 분리하는 것과 관련된 단계에 대한 간략한 전망을 제공합니다. 종양 샘플과 요오딕산올/자당 구배(빨간색 점선으로 원으로 표시) 후의 핵 띠에 대한 대표 이미지가 표시됩니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EDTA (0.5 M)써모 사이언티픽(Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL 원뿔형 원심분리기
튜브		피셔 사이언티픽352096
요오딕산올(일명 Optiprep)줄기세포 기술제07820
NP-40아브캠AB142227
안전 잠금 튜브 1.5 mL에펜도르프0030120086
안전 잠금 튜브 2.0 mL에펜도르프0030120094
자당시그마S0389
광구경 피펫 팁(1000 μL)테모 피셔 사이언티픽2079GPK(영국 대표)
광폭 피펫 팁(200 μL)테모 피셔 사이언티픽2069GPK(유엔 제외)
) 호

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