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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 동결 보존된 뇌 조직 절편의 고정 및 염색
- RNA 무결성을 유지하려면 RNase 세척 용액과 함께 사용할 모든 기기를 세척하십시오. 흄 후드 내부의 고정 및 염색 프로토콜을 진행하십시오.
- 깨끗한 RNase-free 50mL 튜브에 설명된 정착 용액을 준비합니다. 염색 당일에 RNase가 없는 물로 모든 용액을 만드십시오.
- 같은 날 레이저 현미해부를 실시하고 100%, 95%, 70%, 50% 에탄올 용액을 준비합니다. 용액을 실온에서 단단히 닫힌 튜브에 보관하십시오.
- 75% 에탄올 용액에 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신 Y를 준비합니다. 용액을 1분 동안 격렬하게 소용돌이치고 0.45μm 나일론 필터를 통해 여과하여 용해되지 않은 분말의 흔적을 제거합니다.
- 조직 슬라이드를 95% 에탄올이 든 용기에 30초 동안 놓습니다. 75% 에탄올이 들어 있는 튜브로 슬라이드를 옮기고 30초 동안 슬라이드를 그대로 둡니다.
- 슬라이드를 50% 에탄올로 옮기고 25초 동안 그대로 둡니다. 이 시점에서 OCT는 해산됩니다. 슬라이드를 4% 크레실 바이올렛 용액으로 20초 동안 옮긴 다음 0.5% 에오신 Y 용액으로 5초 동안 옮깁니다.
- 염료 용액에서 슬라이드를 꺼내고 여과지로 슬라이드를 닦아내십시오. 그런 다음 슬라이드를 50% 에탄올에 25초 동안 놓습니다. 슬라이드를 75% 에탄올로 25초 동안 옮깁니다. 슬라이드를 95% 에탄올로 30초 동안 옮깁니다. 슬라이드를 100% 에탄올로 60초 동안 옮깁니다.
- 슬라이드를 자일렌으로 헹굽니다. 자일렌이 든 용기에 옮기고 3분 정도 기다립니다.
- RNase가 없는 물에 장착 매체(예: Pinpoint gum)를 준비합니다. 마우스 뇌 단면을 장착하려면 RNase가 없는 물에 장착 매체를 1:10의 비율로 희석합니다.
- RNase가 없는 표면에서 슬라이드를 실온에서 10초 동안 건조시킵니다. 자일렌이 마르기 전에 조직 섹션이 있는 슬라이드를 장착하십시오.
- 멸균 및 RNase가 없는 얇은 페인트 브러시로 슬라이드의 조직 위에 장착 용액을 부드럽게 분산시킵니다. 10-20초 정도 기다린 후 조직 슬라이드를 즉시 현미경 현미해부 플랫폼으로 옮깁니다.
참고: 장착에 사용되는 RNase-free 물에 대한 장착 매체의 비율은 관심 조직에 따라 다릅니다. 장착 매체/수분 비율은 RNA 무결성에 영향을 주지 않고 레이저 현미해부를 위한 신경교종 조직 형태를 보존합니다.