마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

초록

출처: Ji, Z. et al. 실험적 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계의 림프구 침투에 대한 유세포 분석. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 뇌에서 단세포 현탁액 준비

1. 15mL 코니컬 튜브에서 PBS와 함께 밀도 구배 배지를 9:1 비율로 희석하여 최종 100% 용액을 생성합니다.
2. EAE가 최고조에 달한 마우스를 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)의 복강 내 주사로 마취하고 20mL의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS를 심내 관류합니다. 20mL 주사기를 사용하여 PBS를 심장의 좌심실에 천천히 꾸준히 주입하고 우심방을 열어 이를 달성하십시오.
3. 코에서 목까지 두개골을 조심스럽게 자른 다음 두개골 상자에서 뇌를 제거하여 50mL 원추형 튜브에 10mL의 RPMI를 넣습니다. 잘 섞어 부착 된 적혈구를 제거하십시오. 그런 다음 흡인으로 배지를 제거하고 RPMI 10mL를 추가합니다.
4. 뇌와 매체를 100mm 접시에 담습니다. 면도날로 잘게 자릅니다.
5. 깨끗한 피펫을 사용하여 접시에서 6mL를 얼음처럼 차가운 7mL 소결 유리 균질기로 옮깁니다. 피펫에 많은 양의 조직을 남기지 마십시오. 소량은 피할 수 없습니다.
6. 먼저 유봉의 "느슨한" 플런저를 사용하여 뇌를 갈아낸 다음 현탁액이 균질해질 때까지 "단단한" 플런저를 사용하고 미리 냉각된 15mL 원뿔형 튜브에 붓고 얼음 위에 두십시오.
7. 모든 샘플이 균질화되면 부피를 추정합니다. RPMI로 부피를 7mL로 조정합니다. 그런 다음 냉각된 15mL 코니컬 원심분리 튜브에 얼음처럼 차가운 100% 기저막 매트릭스 3mL를 넣고 뇌 균질액 7mL를 추가하여 최종 30% 밀도 구배 배지를 생성합니다. 반전으로 몇 번 섞습니다. 소용돌이치지 마십시오.
8. 선명한 계면을 보장하려면 3mL 피펫을 사용하여 RPMI에 1mL의 70% 언더레이 밀도 구배 매체를 조심스럽게 천천히 추가합니다.
9. 800 x g에서 4°C에서 20분 동안만 원심분리기. 가속을 1로, 감속을 0으로 설정합니다. 원심분리 후 거의 모든 상부 단계를 흡인하고 상단의 미엘린을 완전히 제거하도록 주의합니다(그림 1).
10. 새 15 원심분리기 튜브로 인터페이스를 제거합니다. RPMI를 사용하여 부피를 10mL로 조정합니다.
11. 500 x g에서 10분 동안 원심분리기 원심분리 후 상층액을 흡인합니다. ~200 μL의 유세포 분석(FSC) 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

결과

그림 1: 단핵 세포의 분리를 위한 Percoll gradient setup의 개략도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

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