유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

초록

출처: Bezstarosti, K. et al. 펩타이드 농축 및 질량 분석법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출. J. Vis. 특급. (2020년)

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 유비퀴틴화 펩타이드 추출

1. 트립틱 펩타이드를 분별하기 위해 빈 컬럼 카트리지에 로드된 고분자 고정상 물질(300Å, 50μM, 재료 표 참조)과 함께 높은 pH 역상(RP) C18 크로마토그래피를 사용합니다. 고정상층 크기는 분획할 단백질 분해량에 맞게 조정해야 합니다. ~10mg의 단백질 분해를 위해 0.5g의 고정상 물질로 채워진 빈 6mL 컬럼 카트리지(재료 표 참조)를 준비합니다. 단백질 분해 대 고정상 비율은 약 1:50(w/w)이어야 합니다.
2. 준비된 컬럼에 펩타이드를 로드하고 0.1% TFA의 약 10 컬럼 부피로 컬럼을 세척한 다음 약 10 컬럼 부피의 H2O로 컬럼을 세척합니다.
3. 펩타이드를 각각 7%, 13.5% 및 50% 아세토니트릴(AcN)이 포함된 10mM 포름산암모늄 용액(pH = 10)의 10 컬럼 부피를 가진 3개의 분획으로 용리합니다. 모든 분획을 완전하게 동결 건조합니다.
4. diGly 펩타이드의 면역 농축을 위해 단백질 A 아가로스 비드에 접합된 유비퀴틴 잔류 모티프(K-ε-GG) 항체를 사용합니다. 비드 배치당 항체의 정확한 양은 독점 정보이며 제조업체가 공개하지 않기 때문에 혼동을 피하기 위해 제조업체가 공개하는 것과 동일한 정의를 비드 배치에 사용하는 것이 좋습니다. 이 비드 1회분을 PBS로 2회 세척하고 비드 슬러리를 6등분수로 나눕니다. 자세한 실험 계획은 그림 1을 참조하십시오.
5. 단계 1.3에서 수집된 3개의 펩타이드 분획을 50mM MOPS, 10mM 인산나트륨 및 50mM NaCl(pH = 7.2)로 구성된 완충액 1.4mL에 용해시키고 잔해를 스핀다운합니다.
6. 분획의 상등액을 diGly 항체 비드에 첨가하고 rotator unit에서 4 °C에서 2 h 동안 배양합니다. 비드를 스핀다운하고 상층액을 새로운 항체 비드 배치로 옮기고 4°C에서 2시간 동안 다시 배양합니다.
7. 후속 글로벌 단백질체(GP) 분석을 위해 상등액을 보관합니다.
8. 모든 분획의 비드를 GF/F 필터 플러그가 장착된 200 μL 피펫 팁으로 옮겨 비드를 고정합니다. 비드가 있는 피펫 팁을 원심분리기 팁 어댑터가 장착된 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 200μL의 얼음처럼 차가운 IAP 버퍼로 비드를 3번 세척한 후 200μL의 얼음처럼 차가운 Milli-Q H₂O로 3번 세척합니다. 모든 세척 단계 전에 2분 동안 200 x g의 속도로 컬럼을 회전시키되 컬럼이 건조되지 않도록 주의하십시오. 0.15% TFA의 50μL를 2회 사용하여 펩타이드를 용리합니다.
9. C18 스테이지 팁(기본적으로 2개의 C18 디스크가 있는 200μL 피펫 팁)을 사용하여 펩타이드를 탈염하고 진공 원심분리를 사용하여 완전히 건조합니다.

결과

그림 1: 실험 개요.(A) 실험적 접근 방식의 개요. 샘플을 준비하고, 트립신화하고, pH 용리가 높은 역상 크로마토그래피를 사용하여 3개의 분획으로 분획했습니다. 시판되는 α-diGly 펩타이드 항체 비드 1회분을 6개의 동일한 분획으로 분할한 후 3개의 펩타이드 분획을 3개의 비드 분획에 적재했습니다. diGly 펩티드를 면역 정제, 용출 및 수집하고, 이어서 플로우스루를 3개의 나머지 신선한 비드 분획으로 전달했습니다. 수집된 diGly 펩타이드는 펩타이드 단편화를 위해 가장 강렬한 피크를 먼저 선택하는 한 사이클과 가장 덜 강렬한 피크를 먼저 선택하는 다음 사이클을 결합하는 2단계 체계에 따라 Lumos Orbitrap 질량 분석기에서 질량 분석법으로 분석되었습니다. 그런 다음 MaxQuant를 사용하여 nLC-MS/MS 실행의 전체 세트를 분석했습니다. (B<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
리실 엔도펩티다아제(LysC)	Wako 순수 화학 물질	Tel.: 129-02541
나노LC 오븐	MPI 디자인, MS Wil GmbH
N-라우로일사르코신 나트륨 염	시그마-알드리치	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos 질량 분광기	써모피셔
PLRP-S (300 Ø, 50 μm) 고분자 역상 입자	애질런트 테크놀로지스	PL1412-2K01
PTMScan 유비퀴틴 잔여 모티프 (K-ε-GG) 키트	세포 신호 전달 기술	5562
Sep-Pak tC18 6cc Vac 카트리지	바다	WAT036790	에서 tC18 재료를 제거합니다. 카트리지를 채우기 전에 카트리지 PLRP-S 포함
나트륨 deoxycholate	시그마-알드리치	30970
트리스 베이스	시그마-알드리치	T6066
트리스 - HCl	시그마-알드리치	T5941
트립신, TPCK 처리	써모피셔	20233