DNA Synthesis Assay: A technique to assess DNA synthesis in proliferating cells using radioactive tritiated thymidine incorporation(방사성 트리티화 티미딘 결합을 사용하여 증식 세포에서 DNA 합성을 평가하는 기술)

초록

출처: Williams, M. et al. 인간 신경 전구 세포(NPC)에서 신경 발달 표현형의 신속한 감지. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 방사성 추적자 트리티딘이 세포의 DNA에 혼입되는 것을 측정하여 신경 전구 세포의 증식 능력을 결정합니다. 이 기술은 특정 약물 및 성장 인자로 치료한 후 세포 증식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. NPC 관리

1. 150만 개의 세포 밀도로 NPC를 2mL의 100% 팽창 배지를 함유한 ECM 모방 젤 코팅 웰에 플레이트
화합니다.
2. 5% CO₂로 습한 환경에서 37°C에서 NPC를 배양합니다.
3. 과도한 세포 사멸을 방지하기 위해 P3 이하의 NPC 또는 해동된 NPC의 경우 배지에 5μM의 ROCK 억제제를 추가합니다. 24시간 후에 매체를 교체하여 ROCK 억제제를 제거하십시오.
4. 4-9일마다 배후 세포가 합류하는 시기에 따라 다릅니다. 세포는 접시 표면의 바닥 전체를 덮는 조밀하게 채워진 단층이 될 때 합류하는 것으로 간주됩니다.
5. 6-well 플레이트의 1웰당 1-150만 개의 세포 밀도로 NPC를 플레이트화합니다. 사용한 배지를 48시간마다 제거하고 100% 확장 배지 2mL로 교체합니다.

3. 신경 전구체 세포 DNA 합성 분석

1. 24웰 플레이트에 100,000개의 세포/웰을 플레이트화하고 3중/상태로 평가합니다.
2. 배양 46시간 후 각 웰의 배양 배지(1.5μCi/mL)에 방사성 트리티화[^3H]....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고급 DMEM/F12 미디엄	ThermoFischer 사이언티픽	제12634-010	100% 확장 매체의 구성 요소
Neurobasal 배지	ThermoFischer 사이언티픽	21103049
24웰 플레이트	ThermoFischer 사이언티픽	2021-05	폴리스티렌 플레이트: NPC DNA 합성 분석에 사용
천연 마우스 라미닌	인비트로젠	23017-015	코팅 플레이트용 기판: NPC DNA 합성, S-Phase Entry 및 Cell Number Assay에 사용
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFischer 사이언티픽	15140122	항생제, 팽창 매체의 성분
2.5% 트립신(10배)	지브코	제15090-046	10X 효소 용액
0.5 M 에다	ThermoFischer 사이언티픽	AM9261	DNA 종합 분석실험을 위해 세포를 들어 올리기 위해 트립신 용액에 사용
트리티화 [3H]-티미딘	퍼킨엘머	NET027E001	방사성 트리튬, 티미딘
Fisherbrand 7 mL HDPE 섬광 바이알	피셔브랜드	03-337-1	액체 섬광 계수를 위한 바이알
에코라이트(+)	MP 바이오메디컬	188247501	리퀴드 신틸레이션 칵테일
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