NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

초록

출처: Williams, M. et al. 인간 신경 전구 세포(NPC)에서 신경 발달 표현형의 신속한 감지.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

프로토콜

1. NPC 신경구 이동 분석

1. 신경구 형성
   1. 코팅 기판이 없는 35mm 접시에 1mL의 100% 팽창 매체를 추가합니다. NPC를 플레이팅하기 전에 37°C에서 최소 15분 동안 접시를 배양합니다.세포 이동 분석을 위한 충분한 신경구가 있는지 확인하기 위해 2-3개의 접시를 준비합니다.
      메모: 코팅 기판이 없기 때문에 NPC가 매체에 부유 상태로 유지되며, 이는 신경구 형성에 필수적입니다. 접시를 코팅하면 신경권 형성을 방지할 수 있습니다.
   2. 세포를 들어 올리고, 해리하고, 펠릿화합니다. 2–5mL의 예열된 100% 팽창 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 섹션 1.1.1에서 준비한 각 35mm 접시에 100만 명의 NPC를 접시에 담습니다.
   3. NPC가 37°C에서 48-96시간 동안 배양하여 NPC가 응집되고 신경구를 형성할 수 있도록 합니다. 위상차 현미경에서 살아있는 자를 사용하여 구체의 크기를 평가합니다. 대부분의 구가 대략 100μm(± 20μm)의 직경에 도달할 때까지 기다립니다(그림 1). 더 작은 구체는 이동 분석 중에 완전히 분산되고 분해됩니다.
2. Neurosphere Migration Assay를 위한 플레이트 준비
   1. ECM-mimic gel 분취액을 6mL의 30% 팽창 배지에 용해시킵니다. ECM-mimic gel/30% Expansion Media 솔루션이 준비되면 원하는 농도로 비히클, 성장 인자 또는 관심 약물을 추가합니다.
      메모: 섹션 1.3에서 200μL의 신경구체를 추가하기 위해 비히클, 약물 및 성장 인자 농도를 증가시켜야 합니다.
   2. ECM-mimic gel /30% Expansion Media 용액(± 차량, 성장 인자 또는 약물) 1mL를 6웰 플레이트의 1웰에 플레이트화합니다. 실험 조건당 2-3개의 웰을 만듭니다. 또는 35mm 접시를 사용할 수 있습니다. 37°C에서 최소 30분 동안 플레이트를 배양합니다^.
      메모: 이 분석을 위해 ECM-mimic gel/30% Expansion Media 용액을 흡입하지 마십시오. 흡인된 ECM-Mimic 겔에 구체를 도금하면 빠르고 과도한 이동이 발생합니다.
3. 도금 신경구
   1. 섹션 1.1에서 형성된 신경구를 모아 원뿔형 튜브에 넣습니다. 35mm 접시를 1x PBS 1mL로 세척하여 모든 신경구가 수집되었는지 확인합니다. 수집된 신경구를 100 x g에서 5분 동안 회전시킵니다.
   2. 1-3mL의 예열된 30% 팽창 배지에 신경구를 재현탁합니다. 신경구체 접시 1개를 수집하면 1mL의 배지를 사용하여 구체를 재현탁합니다. 접시 2개를 모으면 2mL의 배지를 추가하여 구체 등을 재현탁합니다. 부드럽게 피펫팅하고 P-1000만 사용하여 구체가 깨지지 않도록 합니다.
   3. 재부유된 신경구체의 200μL를 섹션 1.2에서 만든 ECM-mimic gel/30% Expansion 용액에 플레이트합니다. 신경구를 고르게 분포시키기 위해 모든 방향으로 암판을 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   4. ECM-mimic gel/30% Expansion Media 용액을 제거하고 세포를 4% PFA로 고정하고 세척한 다음 1x PBS + 0.05% Sodium Azide로 세포를 유지합니다.
4. 신경구 분석
   1. 10X에서 위상차 설정을 사용하여 전체 신경구의 이미지를 획득합니다.구체가 서로 닿지 않는지 확인합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 마이그레이션을 측정합니다.
   2. 자유형 선 도구를 사용하여 신경구의 외부 윤곽을 추적합니다. 자유형 선은 "직선" 선 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 액세스할 수 있습니다. 마우스를 사용하여 수동으로 추적합니다.
   3. measure 함수를 사용하여 트레이스 영역을 계산합니다. Analyze(분석) 탭 아래에 있는 "Set Measurements(측정 설정)" 창에서 판독값으로 "area(영역)"가 선택되어 있는지 확인합니다. 파란색으로 표시된 외부 윤곽의 추적은 그림 2를 참조하십시오.
   4. 구의 내부 세포 질량을 추적하고 면적을 측정합니다. 빨간색으로 표시된 내부 윤곽의 추적은 그림 2를 참조하십시오. 전체 신경구 영역에서 내부 세포 질량을 빼서 평균 이동을 정량화합니다.
   5. 세포가 연속적인 카펫으로 이동하면서 조밀하게 채워진 내부 세포 덩어리를 나타내는 신경구를 측정합니다(그림 2).
   6. 측정을 위해 카펫 외부의 세포나 신경구에서 분리된 세포를 포함하지 마십시오. 그림 2를 참조하여 외부 카펫 측정에서 제외된 세포(흰색 원으로 표시)의 예를 확인하십시오. 각 상태에 대해 최소 20개의 신경구를 분석합니다.

결과

그림 1: 이동 분석을 위한 신경구체 선택.(A) 24시간 시점의 대표적인 신경구체 필드의 위상차 이미지. 구체는 모두 100μm 미만이므로 이동 분석을 위해 수집되지 않습니다. (B) 72시간에서 신경구의 대표적인 필드의 위상차 이미지. 모든 구체는 100μm ± 20μm 범위 내에 있으며, 이는 마이그레이션 분석을 위해 수집할 준비가 되었음을 나타냅니다.

그림 2: 마이그레이션 정량화. (A) 대표적인 신경구의 위상차 이미지. (B) 파란색 윤곽선은 전체 신경구 면적을 측정하기 위한 추적을 표시합니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal 배지	ThermoFischer 사이언티픽	21103049	NIM 및 100% 확장 매체의 구성 요소
PSC 신경 유도 매체: 프로토콜 링크: https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer 사이언티픽	A1647801	이 키트는 NB(Neurobasal) 배지와 50x NIS(Neural Induction Supplement)로 구성되어 있습니다. NIS는 1X 신경 유도 매체 및 100% 확장 매체를 만드는 데 사용됩니다.
고급 DMEM/F12 미디엄	ThermoFischer 사이언티픽	제12634-010	100% 확장 매체의 구성 요소
hESC 인증 마트리겔	코 닝	354277	hESC 인증 세포외 기질모방 겔(ECM-mimic gel)
6웰 플레이트	코 닝	코어-3506	NPC 유지 관리 및 신경구 이동 분석에 사용되는 폴리스티렌 플레이트
휴먼 베이직 FGF-2	페프로텍	100-18B	성장 요인
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFischer 사이언티픽	15140122	항생제, NIM 성분, 100% 팽창 및 30% 팽창 매체

호