성상세포 분리: 마우스 피질 성상세포의 순수한 준비를 얻는 방법

초록

출처: Schildge, S. et al. 마우스 피질 성상세포의 격리 및 배양. J. Vis. 특급 (2013년)

이 비디오에서는 새로 태어난 마우스에서 성상세포를 순수하게 제제하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 혼합 피질 세포의 분리 및 도금

성상교세포 배양을 위한 혼합 피질 세포 분리는 P1에서 P4 마우스 새끼를 사용하여 수행할 수 있습니다. 적절한 성상세포 밀도를 달성하려면 T75 조직 배양 플라스크당 4개의 마우스 강아지 피질을 사용해야 합니다. 따라서 다음 프로토콜의 부피는 4마리의 새끼 마우스를 사용한 세포 준비에 대해 계산됩니다.

1. 해부 절차를 시작하기 전에 성상세포 배양 배지 30mL(DMEM, 고포도당 + 10% 열 비활성화 소 태아 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신, 표 참조)를 37°C로 예열합니다. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 세포 배양 등급 물에 50μg/mL 농도의 20mL poly-D-lysine(PDL) 20mL를 T75 플라스크 1개에 코팅합니다.
2. 해부 절차를 위해 필요한 모든 시약과 재료를 준비하십시오. 수술용 가위, 부드러운 가는 집게, 평평한 끝 집게, 종이 타월, 쓰레기 봉투, 70% 에탄올, 각각 2mL HBSS를 채운 얼음에 해부 접시 2개(직경 3.5cm)가 필요합니다.
3. 강아지 쥐의 머리와 목에 70% 에탄올을 부드럽게 잡고 뿌립니다. 동물은 가위를 사용하여 참수하여 희생됩니다.
4. 두피를 따라 뒤쪽에서 앞쪽으로 정중선을 절개하여 두개골을 드러냅니다.
5. 목에서 코까지 두개골을 조심스럽게 자릅니다. 뇌에 더 많이 접근할 수 있도록 두 번의 추가 절단이 수행됩니다: 첫 번째 절단은 후각구의 앞쪽에 만들어지고, 다른 하나는 두개골 기저부에서 두개골을 분리하기 위해 소뇌의 아래쪽에 만듭니다.
6. 납작한 끝 집게를 사용하여 두개골 플랩을 부드럽게 옆으로 뒤집고 뇌를 꺼내어 HBSS로 채워진 첫 번째 해부 접시에 넣습니다. 접시를 다시 얼음 위에 놓고 4개의 뇌를 모두 계속 수확합니다.
7. 해부 절차의 나머지 부분은 실체 현미경으로 수행됩니다. 먼저, 미세한 절개 겸자를 사용하여 후각구와 소뇌를 제거합니다(그림 1B).
8. 피질을 회수하기 위해서는 가는 겸자로 뇌의 뒤쪽 끝을 잡고, 반구 사이를 절개하고, 만들어진 숲에 두 번째 집게를 삽입하고, 뇌에서 피질의 판 같은 구조를 벗겨낸다.
9. 미세한 집게로 잡아당겨 피질 반구에서 수막을 조심스럽게 해부합니다(그림 1D'). 이 단계는 수막 세포와 섬유아세포에 의한 최종 성상세포 배양의 오염을 방지합니다. 준비된 피질 반구를 HBSS로 채워진 두 번째 접시에 옮기고 얼음 위에 다시 놓습니다. 4개의 피질 모두에 따라 계속하십시오.
10. 마지막으로 날카로운 칼날을 사용하여 각 피질 반구를 작은 조각으로 자릅니다(약 4-8회).
11. 멸균 상태에서 피질 조각을 하나의 50mL Falcon 튜브로 옮기고 HBSS를 총 22.5mL 부피에 추가합니다.
12. 2.5 mL의 2.5 % 트립신을 첨가하고, 조직을 혼합하여 37 °C의 수조에서 30 분 동안 배양합니다. 10 분마다 가끔 흔들어서 혼합합니다.
13. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 피질 조직 조각을 펠릿화합니다.
14. 디캔테이션으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 조직 펠릿을 잃지 않기 위해 피펫을 사용하여 기계적으로 유지할 수 있습니다. 조직 조각이 단일 세포로 해리될 때까지 10mL 성상세포 도금 배지를 추가하고 10mL 플라스틱 피펫을 사용하여 격렬한 피펫팅을 하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다(20-30회). 성상교세포 도금 배지를 사용하여 부피를 20mL로 조정합니다. 피질 조직이 단일 세포로 해리되는 것은 혈구계를 사용하여 계수하여 증명할 수 있습니다. 4개의 쥐 새끼 피질을 한 번 준비하면 10-15 x10⁶개의 해리된 단일 세포가 생성되어야 합니다.
15. T75 배양 플라스크에서 PDL을 흡인하고, 해리된 단일 세포 현탁액을 플레이트에 입히고, CO₂ 인큐베이터에서 37°C의 온도로 배양합니다.

2. 풍부한 성상세포 배양 획득

1. 혼합된 피질 세포를 도금한 후 2일 후와 그 후 3일 동안 배지를 변경합니다.
2. 7-8일 후, 성상세포가 합류하여 중첩된 미세아교세포가 성상세포층에 노출되어 있거나 이미 성상세포층에서 분리된 경우(그림 2), 안와 쉐이커에서 30분 동안 T75 플라스크를 흔들어 미세아교세포를 제거합니다. 미세아교세포가 함유된 상등액을 버리거나 미세아교세포를 배양하고 검사하려면 스핀다운하고 플레이트에 배양하여 배양하십시오.
3. 20mL의 새로운 성상세포 배양 배지를 추가하고 플라스크를 240rpm으로 6시간 동안 흔들어 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 제거합니다. 일부 OPC는 성상세포층에서 완전히 분리되지 않으므로 OPC 오염을 방지하기 위해 1분 동안 손으로 계속 세게 흔듭니다. OPC를 배양하려는 경우 상등액을 버리거나 스핀다운하고 플레이트
화하십시오.
4. 나머지 합류 성상세포층을 PBS로 두 번 헹구고, PBS를 흡인하고, 5mL 트립신-EDTA를 추가하고, 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다.5분마다 성상세포의 분리를 확인하고 플라스크를 손바닥에 대고 두드려 성상세포의 분리를 강제합니다(2-3회).
5. 배양 플라스크에서 성상세포를 분리한 후 5mL의 성상세포 배양 배지를 첨가하고 180 x g에서 5분 동안 세포를 스핀시킨 후 상층액을 흡인하고 40mL의 새로운 성상세포 도금 배지를 추가합니다. 하나의 T75 조직 배양 플라스크는 첫 번째 세포 분할 후 약 1x10⁶ 세포를 생성해야 합니다. 두 개의 T75 배양 플라스크에 플레이트셀을 넣고 CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.
6. 첫 번째 분할 후 12-14일 후에 성상세포를 실험을 수행하기 24-48시간 전에 적절한 세포 농도로 도말합니다. 하나의 T75 조직 배양 플라스크는 두 번째 세포 분할 후 약 1.5–2 x10⁶ 세포를 생성해야 합니다.

결과

그림 1. 출생 후(P3) 마우스 피질 해부.A) 전뇌. B) 후각구와 소뇌를 제거한 후의 뇌. C) 뇌에서 피질의 판 같은 구조를 벗겨냄으로써 피질을 격리한다. D, D') 수막이 있는 복부 및 등쪽 부위의 피질(검은색 화살표는 수막 동맥을 나타냄). E) 수막이 없는 피질. 눈금자, 1.5mm.

그림 2. 분리 후 다른 시점에서의 분리된 혼합 피질 세포와 순수 성상 세포 배양에 대한 형태학적 개요.A) 혼합 피질 세포를 도금한 후 1일. 첫째, 성상세포(astrocyte)는 플라스크의 바닥(검은색 화살표)에 부착되어 있고 죽어...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
성상세포 배양 배지
DMEM 고포도당	생명 기술	31966-021
FBS 열 비활성화	생명 기술	제10082-147	최종 농도 : 10 %
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	15140-122	최종 농도 : 1 %
뇌 조직 소화를 위한 솔루션
HBSS (하이브에스)	생명 기술	제14170-088
2.5% 트립신	생명 기술	제15090-046	최종 농도 : 0.25 %
다른
70%(vol/vol) 에탄올	로스	9065.2
폴리-D-라이신	밀리퍼 A-003	A-003-E
물	파아	시즌 15-012	세포 배양 등급
PBS (PBS)	파아	H15-002	세포 배양 등급
0.05% 트립신-EDTA	생명 기술	제25300-062
0.45μm 제균 필터	싸토리우스	16555
3.5cm 페트리 접시	BD 팔콘	353001
15ml 팔콘 튜브	BD 팔콘	352096
50ml 팔콘 튜브	BD 팔콘	352070
75 cm2 조직 배양 플라스크	BD 팔콘	353136
겸자 미세함	뒤몽	2-1032년; 2-1033	#3c; #5
집게 플랫 팁	KLS 마틴	12-120-11
13cm 수술용 가위	에스큘랍	기원전-140-R
실체현미경	라이카		MZ7.5
실체현미경 + 카메라	라이카		MZ16F; 재질 보기 DFC320
현미경 + 카메라	자이스; 카논		프리모 버트; 파워샷 A650 IS
원심 분리기	에펜도르프	5805000.017	원심분리기5804R
오비탈 셰이커	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	쉬케 4450-1CE	맥스Q 4450
수조	줄라보		SW20; 37 °C

년 호 년 호 호 호 년 년 )