쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

초록

출처: Molino, Y. et al. 쥐 혈액 뇌 장벽(BBB)의 체외 모델 설정: BBB 불투과성 및 수용체 매개 수송에 대한 초점. J. Vis. 특급.(2014년)

이 비디오는 밀도 구배 원심분리와 효소 소화 메호드의 조합을 사용하여 쥐의 뇌에서 미세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 미세혈관은 콜라겐과 피브로넥틴 매트릭스로 사전 코팅된 배양 플라스크에서 배양하여 내피 세포 콜로니를 얻을 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 쥐 뇌 미세혈관의 분리

1. 각 준비와 한 명의 실험자에 대해 5주 된 Wistar 쥐 3마리를 사용합니다.
2. 첫 번째 주 월요일, 멸균 배양수(T75당 10ml)에서 콜라겐 IV형과 피브로넥틴으로 코팅하여 T75 플라스크 2개를 준비합니다. 마이크로혈관 파종까지 37°C에서 준수하도록 합니다.
3. 첫 번째 주 수요일 아침, 졸음, 자세 상실 및 호흡 중단을 유발하기 위해 증가하는 CO₂ 흐름 아래에서 쥐를 안락사시킨 다음 경부 탈구를 유발합니다. 머리에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위로 머리를 자르고 층류 후드 아래의 마른 페트리 접시에 옮깁니다.
4. 소뇌와 시신경이 없는 두개골에서 뇌를 제거한 다음 얼음으로 식힌 후 냉 해부 완충액(HBSS, 1% BSA, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml)으로 채워진 페트리 접시에 넣습니다.
5. 뇌를 반으로 잘라 2개의 대뇌 반구를 분리하고 중뇌와 전뇌를 분리합니다. 전뇌를 해부 완충액이 있는 얼음 위의 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다.
6. 차가운 해부 완충액이 있는 새 페트리 접시에 반구 두 개를 넣고 N° 5 곡선 겸자가 있는 실체 현미경으로 전뇌의 수막을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 뇌 내부를 청소하여 미엘린 이불을 제거하고 피질 껍질을 얻습니다. 이러한 단계는 조직 보존 및 세포 생존에 2시간 이상 걸리지 않아야 합니다.
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7. 뇌에서 피질을 해리 7 mL dounce 균질화기에 있는 찬 해부 완충액의 6 mL를 10 여기저기 치기에 의하여 다른 clearances, 71 μm 후에 20 μm
.
8. 현탁액을 나누어 50mL Falcon 튜브 1mL에 1피질에 해당하는 양을 얻고 RT에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 폐기합니다.
9. 콜라겐분해효소/디스파제(60μg/mL–0.3U/mL), DNase I형(35μg/mL–20K 단위/mL) 및 겐타마이신(50μg/mL)의 혼합물을 함유한 효소 용액 1mL와 함께 1피질의 현탁액을 37°C에서 30분 동안 셰이커에 분해합니다.
10. 1 피질에서 추출한 1 mL digest를 25 % BSA/HBSS 1X 10 mL와 혼합하고 3,600 x g에서 RT에서 15분 동안 밀도 의존적 원심분리를 합니다.상부 디스크(미엘린 및 뇌 실질)와 상층액을 깨끗한 50 mL Falcon tube에 조심스럽게 옮기고 원심분리를 반복합니다. 생성된 펠릿은 뇌 미세혈관을 포함하는 결과를 4°C로 유지합니다.
11. 상부 디스크와 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 생성된 두 펠릿을 1mL의 차가운 HBSS 1X로 재현탁하고 깨끗한 50mL Falcon 튜브로 옮깁니다.
12. 차가운 HBSS 1X 20mL를 첨가하고 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 미세혈관을 세척합니다. 상층액을 폐기합니다.
13. 또한, 셰이커에서 37°C에서 1시간 동안 단계 1.9에 설명된 것과 동일한 효소 용액 1mL로 1피질의 미세혈관을 분해합니다.
14. 그런 다음 3개의 피질 각각에서 분해된 미세혈관을 하나의 튜브에 혼합하고 추가로 2개의 50mL Falcon 튜브로 분리하여 튜브당 1.5개의 피질에 해당하는 미세혈관을 얻습니다. 30mL의 냉간 해부 완충액과 원심분리를 1,000 x g의 RT에서 5분 동안 추가합니다.
15. 20% 소 혈소판 부족 혈장 유래 혈청, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 2ng/mL), 헤파린(100μg/mL), 겐타마이신(50μg/mL) 및 HEPES(2.5mM)가 보충된 DMEM/F12 10mL에 미세혈관 펠릿을 재현탁하며, 4μg/mL의 퓨로마이신이 보충된 내피 세포 배지(ECM)라고 합니다.
16. 인큐베이터에서 코팅된 T75 플라스크 2개를 꺼내 코팅을 과도하게 흡인하고 각 튜브의 미세혈관을 하나의 T75 플라스크(T75 플라스크당 1.5피질에서 추출한 미세혈관)에 플레이트합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 태아 세럼	인비트로젠	제10270-098	-20 °C / 1 년
BSA 분획 V 낮은 내독소	파아	K45-011-500G	4 기음
페니실린-스트렙토마이신	인비트로젠	15140-122	-20 °C
T75 플라스크	Becton 디킨슨 팔콘	353135
HEPES 완충액 (1M)	인비트로젠	제15630-056	4 °C / 1 년
콜라겐 IV형 마우스(10 x 1mg)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	356233	-20 °C / 1 개월
피브로넥틴 휴메인 혈장(5mg)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	356008	-20 °C / 1 개월
Vannas 스프링 가위, 스트레이트 (9cm)	정밀 과학 도구	91500-09
가위, 스트레이트 (9cm)	정밀 과학 도구	14568-09
뒤몽 겸자#5/45(11cm)	정밀 과학 도구	11251-35
그레이프 집게, 팁 폭 0.8 mm	정밀 과학 도구	11050-10
그레이프 집게, 곡선 팁 너비 0.8 mm	정밀 과학 도구	11051-10
콜라겐 분해 효소 / 디스 페이 아제 믹스 (2 x 5 mg)	로슈진단	05 401 054 001	-20 °C / 3 개월
DNase I (100 mg / 569 KU / mg)	시그마 알드리치	DN25-100 밀리그램	-20 °C / 1 년
겐타마이신(10mg/ml)	인비트로젠	제15710-049	4 °C / 1 년
DMEM/F12	인비트로젠	31331-028	4 기음
혈소판 불량 혈장에서 추출한 소 혈청 (500 ml)	클리니사이언스	BT-214-100	-20 °C / 1 년
bFGF (10 μg)	인비트로젠	제13256-029	-20 °C / 6 개월
돼지 점막에서 추출한 헤파린 Na 소금 등급 I	시그마 알드리치	H3149-100구	4 °C / 1 년
푸로마이신	시그마 알드리치	P8833-10 밀리그램	-20 °C / 6 개월

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