혈액-뇌종양 장벽 또는 BBTB 모델: 종양에 대한 치료제 전달을 평가하기 위한 혈액-뇌 장벽 또는 BBB 모델의 적응

초록

출처: Le Joncour, V. et al. 접시의 혈액뇌종양장벽을 이용한 생체 내 페이로드 전달 예측. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 혈액-뇌 종양 장벽을 모방한 체외 모델을 구축하기 위한 포괄적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 모델은 뇌종양 치료를 위한 치료제의 전달을 이해할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. BBTB 미믹의 설립

참고: 세포 배양 배지 및 보충제는 재료 표에 자세히

설명되어 있습니다.

1. 성상교세포의 준비
   메모: 다음 용량은 10cm 페트리 접시 또는 T75 세포 배양 플라스크에 적합합니다.
   1. 멸균 세포 배양 후드 아래에서 5mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 배양된 성상세포를 조심스럽게 세척합니다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 조심스럽게 폐기하고 세포 해리 시약 2mL를 5분(37°C, 재료 표 참조) 동안 첨가하여 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포 분리를 확인하십시오. 세포에 가해지는 스트레스를 제한하기 위해 5분을 초과하여 배양하지 마십시오.
   2. 10mL의 멸균 완전 성상세포 세포 배양 배지(ABM+)를 용기에 추가하여 세포 해리 시약의 활성을 억제합니다. 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 분리된 세포를 용기에서 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 250rcf(가속: 9rcf/s, 감속: 5rcf/s)에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   3. 한편, 삽입물을 준비합니다(재료 표 참조): 멸균 겸자를 사용하여 뇌 쪽이 위로 향하게(그림 1A) 인서트를 멸균 6웰 플레이트(그림 1B)의 뚜껑에 놓습니다. 공정 중에 인서트를 만지거나 움직이지 않고 플레이트를 인서트에 거꾸로 놓을 수 있는지 미리 확인하십시오.
      참고: 삽입물을 적절하게 배치하면 멤브레인과 웰 바닥 사이에 성상세포 현탁액이 포획될 수 있습니다.
   4. 원심분리가 완료되면 세포 현탁액에서 상등액을 조심스럽게 버리고, 튜브의 벽에 펠릿을 최대 5배까지 부드럽게 재현탁하여 ABM+ 1mL에 성상세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포에 가해지는 스트레스를 제한하기 위해 세포의 과도한 피펫팅을 피하십시오. 세포를 세고 세포 현탁 밀도를 400μL의 ABM+/삽입에서^1.5 x 10 5 세포로 조정합니다.
   5. 세포 현탁액을 삽입막 막의 뇌 쪽 중앙에 놓고(그림 1B) 멸균 피펫 팁으로 모세관 힘을 사용하여 매우 조심스럽게 펴 놓습니다. 멤브레인은 특히 약하므로 직접적인 접촉을 피하십시오.
   6. 인서트의 브레인 쪽이 여전히 위로 향하게 하여 6웰 플레이트를 인서트에 다시 놓습니다. 이렇게 하면 세포 현탁액이 멤브레인과 웰의 실제 바닥 사이에 갇히게 됩니다(그림 1C). 세포 현탁액의 기포는 막에서 성상세포의 균일한 확산을 방지하므로 피하십시오.
   7. 인큐베이터(37°C에서 5% CO₂)에 플레이트와 삽입물을 배치하여 최소 2시간(쥐 불멸화 성상세포) 및 최대 6시간(인간 1차 성상세포) 동안 세포가 접착될 수 있도록 합니다.
      참고: 삽입물이 거꾸로 유지되기 때문에 현미경으로는 세포 접착을 시각화할 수 없습니다. 따라서 별도의 일반 세포 배양 용기를 시딩하고 시간이 지남에 따라 용기의 세포 부착을 제어하는 것이 좋습니다. 멤브레인이 손상되면 결과를 신뢰할 수 없으므로 멤브레인을 신중하게 조작해야 합니다.
   8. 배양 시간이 끝나면 시딩 영역 외부에 세포 현탁액 누출이 없는지 확인하고 누출이 있는 경우 삽입물을 폐기합니다. 6-well 플레이트를 이제 혈액 면이 위로 향하게 하는 인서트를 사용하여 일반 위치로 되돌립니다(그림 1A). 각 웰에 ABM+ 2.6mL를 추가합니다. 각 삽입물에 2.5mL의 완전한 성상교세포 배지를 붓고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다(37°C에서 5% CO₂).

2. 내피 세포의 준비

참고: 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포(bEND3)의 경우, 실험 당일에 최적의 밀착 연접 단백질 발현을 유발하는 최대 세포 간 접촉을 보장하기 위해 세포가 100% 합류점에 도달해야 합니다. 이는 인간 제대 정맥 내피 세포(HuAR2T)의 경우 성상세포의 존재가 필요하기 때문에 이러한 세포의 밀착 접합 단백질 발현에는 적용되지 않습니다.

1. 세포 해리를 위한 성상세포에 대해 앞서 설명한 대로 진행합니다. 일단 원심분리되면 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브 벽의 세포 현탁액을 최대 5배까지 천천히 피펫팅하여 1mL의 완전 내피 세포 배양 배지(EBM+)에 내피 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포에 가해지는 스트레스를 제한하기 위해 세포를 과도하게 피펫팅하지 마십시오. 세포를 세고 세포 현탁 밀도를 혈청(EBM-) 및 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A)가 없는 내피 세포 배양 배지의 2.5mL/삽입에 있는⁵개의 세포로 세포 현탁 밀도를 조정합니다.
2. 삽입물이 들어있는 플레이트를 꺼내고 혈액 측에서 배지를 조심스럽게 버리고 내피 세포 현탁액 2.5mL로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C에서 5% CO₂)로 되돌리고 내피 세포가 멤브레인에 부착될 수 있도록 밤새 그대로 둡니다.
3. 다음 날, 예열된 무혈청 성상세포 배지(ABM-) 3mL를 각 웰에 옮겨 멸균 6웰 플레이트를 준비합니다. 멸균 겸자로 삽입물을 취급하여 혈액 측에서 내피 완전 배지를 조심스럽게 버리고 ABM-이 포함된 새 플레이트에 삽입물을 넣은 다음 EBM-.
   2.5mL를 추가합니다. 메모: EBM-의 사용은 내피 장벽을 확립하는 데 중요합니다.
4. 인큐베이터(37°C에서 5% CO₂)에 삽입물을 5일 동안 물리적 방해와 온도 변화를 최소화하면서 그대로 두어 내피 기저막의 생성, 내피 세포와 성상세포의 접촉, 그리고 궁극적으로 BBTB 모방 형성을 허용합니다. 신경교종 세포 배양에 대한 이식 당일에 배지를 교체하십시오.

3. 신경교종 세포의 준비

참고: 환자 유래 교모세포종 구체가 여기에 사용되지만, 다음 프로토콜은 U-87MG와 같이 상업적으로 이용 가능한 부착성 교모세포종 세포에 쉽게 적용할 수 있습니다.

1. 선택적으로, 면역형광 이미징의 경우, 2mL의 폴리-D-라이신(0.01%)이 포함된 6웰 플레이트에 웰당 최대 4개의 원형 멸균 붕규산 커버슬립(ø 0.9cm)을 배치합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
2. 한편, 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 세포 배양 용기에서 15mL 멸균 튜브로 종양 구체를 조심스럽게 옮깁니다. 250 rcf에서 3분 동안 종양 구체를 원심분리합니다.
3. 상층액을 버리고 bFGF/EGF-free(GBM-) 신경교종 세포 배지 1mL에 구체를 부드럽게 재현탁하고 세포를 계수합니다. GBM-에서 셀 밀도를 약 10⁴ spheres/mL(10⁵ cells/mL)로 조정합니다.
4. 웰에서 poly-D-lysine을 버리고 멸균 PBS로 3번 헹굽니다. 플레이트에 3mL/well의 종양 스페로이드 현탁액을 시딩하고 종양 세포 현탁액에 BBB 모방체를 사용하여 삽입물을 옮깁니다.
5. 하룻밤 동안(37°C에서 5% CO₂로 배양) 혈액과 분석의 뇌종양 측 사이의 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 다음 날에는 혈액 측의 배지를 관심 분자/약물/나노 입자가 보충된 EBM으로 교체합니다. 샘플은 이전 섹션에서 설명한 대로 직접 정량화를 위해 시간이 지남에 따라 수집됩니다. 세포는 형광 이미징을 위해 정확한 시점에 고정됩니다.

결과

그림 1: 혈액-뇌종양-장벽(BBTB) 모델에 대한 설명.(A) 서로 다른 세포 유형의 위치에 대한 개략적 표현. (B) 6-well plate cover의 인서트 배치와 인서트 멤브레인의 뇌 쪽에 있는 성상세포에 대한 시딩 기술의 그림. (C) 성상세포 부착을 허용하는 6-웰 플레이트 배치의 그림. (D) 밀접연접 단백질 zonula occludens-1(ZO-1, 윗줄, 빨간색) 및 claudin-5(아랫줄, 녹색)의 면역형광 현미경 사진. 단백질 발현은 BBTB의 혈액 측에서 단독으로 단일배양(왼쪽 열) 또는 쥐 불멸화된 HIFko 성상세포(오른쪽 열)로 배양된 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포(bEND3)와 비교됩니다. 세포핵은 DAPI(파란색)로 대조염색됩니다. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀
bEND3	증권 시세	CRL-2299	배양액: 10% FBS- 5mL L-글루타민 및 5mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM(1g/L 포도당)
HIFko 불멸의 마우스 성상세포	Dr. Gabriele Bergers 연구실에 격리	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	배양 성분 : 5 % FBS-5 mL, 1 M HEPES-5 mL, 100 mM 나트륨 피루베이트-3 g, D-포도당 및 5 mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 BME-1
화AR2T	Dr. Dagmar Wirth 연구실에서 격리	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	배양: EBM-2 with SupplementMix 정상 인간 1차 성상세포 Lonza CC-2565 배양: ABM with SingleQuots
재료 및 시약
100mm x17mm 접시 Nunclon 델타	써모피셔 사이언티픽	150350
10 mL 혈청학적 피펫	써모피셔 사이언티픽	170361
15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	써모피셔 사이언티픽	339650
ABM 기초 매체 500 mL	론자	CC-3187	원발성 인간 성상세포용. ABM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 함유하고 있습니다. ABM-:rhEGF 및 FBS를 제외한 모든 첨가제
Accutase 세포 분리 솔루션	코 닝	25-058-CI
AGM SingleQuots 보충제 및 성장 요인	론자	CC-4123
B27 보충제	지브코	제17504-044	GBM + 및 - 매체 모두의 경우
기저 미디엄 이글	써모피셔 사이언티픽	21010046	재질 보기 BME-1
Corning Costar TC 처리된 6웰 플레이트	시그마-알드리치	CLS3506
코닝 Transwell 폴리에스테르 멤브레인 세포 배양 인서트	시그마-알드리치	CLS3452
D-포도당	시그마-알드리치	G8270	배지에 추가하기 전에 50mL의 BME-1 및 멸균 필터에 용해시킵니다.
둘베코의 변형 독수리의 미디엄/영양 F-12 햄	지브코	제21331-020	우리 실험실에서 격리된 환자 유래 영역의 배양에 특정적입니다. 다른 신경교종 세포주에 따라 다를 수 있습니다
EBM-2 성장 매체 SupplementMix	프로모셀	C-39216	EBM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 포함합니다. EBM-: VEGF-A 및 FBS를 제외한 모든 첨가제
내피 기저 배지 2(EBM-2)	프로모셀	C-22211	EBM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 포함합니다. EBM-: VEGF-A 및 FBS를 제외한 모든 첨가제
소 태아 혈청(FBS), 적격, 열 불활성화, EU 승인 남미 원산지	써모피셔 사이언티픽	10500056
플루오레세인 나트륨 염	시그마-알드리치	F6377
Greiner CELLSTAR 96웰 플레이트	시그마-알드리치	그라이너 655090	검은 폴리스티렌 우물 평평한 바닥 (마이크로 클리어 바닥 포함)
Menzel-Gläser 0.9cm 원형 붕규산 커버 슬립	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	10313573
PBS 정제	메디카고	09-9400-100	dH2O의 리터 당 1개의 정제; 그 때 압력가마로 소독해서 해결책을 살균하십시오
Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마-알드리치	P6407
재조합 인간 EGF	페프로텍	GMP100-15	GBM+ 매체용
재조합 인간 FGF-basic (154 a.a.)	페프로텍	100-18B	GBM+ 매체용

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