제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술

초록

출처: Mazzolini, J. et al. 애벌레 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포의 분리 및 RNA 추출. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 뇌 조직을 기계적으로 파괴하여 유충 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 정제된 세포 집단은 게놈 분석에 추가로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 균질화

참고: 모든 단계는 4°C에서 수행됩니다.

1. 200μM PTU로 처리된 50mL의 E3 배아 배지에 50마리의 유충이 들어 있는 90mm 페트리 접시에 1.5mL 트리카인(15mM)을 첨가하여 말단 마취합니다.
   1. 3mL 파스퇴르 플라스틱 벌크 피펫으로 페트리 접시에서 마취된 유충 10마리를 빨아들입니다.
   2. 마취된 유충 10 x 10을 얼음처럼 차가운 E3 배아 배지 + 트리카인으로 채워진 55mm 페트리 접시에 옮깁니다.
   3. 실체 현미경으로 페트리 접시 중앙에 10 마리의 유충을 정렬합니다. 그런 다음 수술용 마이크로 가위를 사용하여 난황낭 위의 유충 머리를 절제합니다(머리가 뜨는 것을 방지하기 위해 부레는 제외).
   4. 3mL 파스퇴르 플라스틱 벌크 피펫으로 페트리 접시에서 머리를 빨아들입니다. 모든 헤드가 피펫 팁 내에 모일 때까지 기다린 다음 1mL의 얼음처럼 차가운 배지 A가 들어 있는 유리 균질기로 옮깁니다(E3 + 트리카인에 의한 배지 A 희석을 줄이기 위해 최소한의 부피로 전달). 유리 균질화기를 얼음 위에 보관하십시오. 실험 조건당 하나의 균질기를 사용합니다.
   5. 얼음처럼 차가운 E3 + 트리카인이 들어 있는 각 작은 페트리 접시를 30분마다 새 것으로 교체하여 차가운 E3 + 트리카인 배지에서 절제가 수행되도록 합니다.
   6. 색상이 바래기 시작하면 유리 균질화기의 얼음처럼 차가운 미디어 A를 교체하십시오.
      알림: 미디어 A 희석은 온도 변화로 인해 머리 조직을 변화시킬 수 있습니다.
   7. 모든 헤드가 수집되면(600헤드/상태) 유리 균질기에서 최대 부피의 미디어 A를 제거하고 1mL의 얼음처럼 차가운 새 미디어 A로 교체합니다.
   8. 얼음 위의 단단한 유리 균질기로 뇌 조직을 파괴하십시오. 3-5 dpf 유충은 40 라운드, 7 및 8 dpf 유충은 50 라운드를 분쇄하고 회전합니다.
2. 세포 현탁액(1mL Media A/200 heads)에 2mL의 Media A를 추가하면 세포가 희석되고 미엘린과의 응집체가 감소하여 밀도 구배 배지에서 원심분리 중 분리가 용이해집니다.
   1. 세포 응집을 제거하려면 얼음 위에 유지된 차가운 50mL 매 튜브 위에 놓인 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 실행합니다. 이 작업을 3회 반복합니다.
   2. 1mL의 세포 현탁액을 차가운 1.5mL 튜브에 옮기고 300g에서 4°C에서 10분 동안 회전시킵니다.
   3. 10mL 주사기 + 바늘 23G x 1''을 사용하여 상층액을 제거합니다.
3. 세포 펠릿을 0.5mL의 얼음처럼 차가운 DPBS 1x로 부드럽게 오버레이된 1mL의 얼음처럼 차가운 22% 밀도 구배 매체로 재현탁합니다(혼합하지 마십시오. 두 용액 사이의 계면이 보일 수 있음).
   1. 브레이크 없이 950g에서 튜브를 스핀하고 4°C에서 30분 동안 저속 가속.
      참고: 이 단계는 DPBS 1x 및 22% 밀도 구배 매질의 계면에서 수초를 격리하여 다른 세포와 분리하는 반면, 세포는 튜브 바닥에서 펠릿화됩니다. 수초(myelin) 제거는 세포 농도가 너무 높지 않을 때 더 효율적입니다.
   2. 10mL 주사기 + 바늘 23G x 1''을 사용하여 계면에 갇힌 최대 DPBS, 밀도 구배 매체 및 미엘린을 버립니다.
   3. 0.5mL의 배지 A + 2%의 일반 염소 혈청(NGS)으로 세포를 세척한 다음 300g에서 4°C에서 10분 동안 튜브를 돌립니다.
   4. 최대 상등액을 버리고 동일한 실험 조건의 모든 세포 펠릿을 1mL의 배지 A + 2% NGS에 함께 모읍니다.
4. 관심 세포가 mpeg1:eGFP의 형광 단백질과 같은 대식세포/미세아교세포를 발현하거나 NBT:DsRed 형질전환 물고기의 뉴런을 발현하는 경우, 35μm 세포 여과기 캡을 통해 세포 현탁액을 실행하고 빛으로부터 보호되는 얼음 위의 차가운 5mL FACS 튜브로 옮깁니다.
   참고: 대안적으로, 미세아교세포의 면역염색을 수행할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1-페닐 2-티오우레아(PTU)	시그마	P7629
헤페스	지브코	제15630-056
D-포도당	시그마	G8644-100ML
HBSS 1배	지브코	제14170-088
퍼콜	GE 헬스케어	Tel.: 17-0891-02
HBSS 10배	지브코	제14180-046
DPBS 1배	지브코	제14190-094
트리카인(MS222)	시그마	A5040
스테릴린 표준 90mm 페트리 접시	써모피셔	101비르
외과용 마이크로 가위	정밀 과학 도구	15000-00
3 mL 파스퇴르 플라스틱 벌크 피펫	증권 시세	PIP4206
유리 균질화기	휘튼	357538
Sterilin 표준 55mm 페트리 접시	써모피셔	P55V의
퍼콜	GE 헬스케어	Tel.: 17-0891-02
40μm 세포 스트레이너	송골매	352340
50ml 폴리프로필렌 원추형 튜브	송골매	352070
원심 분리기	에펜도르프	5804 R
일반 염소 혈청(NGS)	세포 신호 전달	5425초
35μm 셀 스트레이너 캡	BD (영어)	352235

(영문) 호 호 호 호 년 표시기 조