Immunostaining Coupled Cell Sorting에 의한 미세아교세포 분리: 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 제브라피시 뇌 세포에서 미세아교세포를 분리하는 면역 염색 방법

Abstract

출처: Mazzolini, J. et al. 애벌레 제브라피시 뇌에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포의 분리 및 RNA 추출. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 면역염색 결합 세포 분류를 통해 제브라피시 미세아교세포를 분리합니다. 분리된 미세아교세포는 뇌 병리학에서 자신의 역할을 이해하기 위해 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미세아교세포 면역염색

참고: 모든 단계는 4°C에서 수행됩니다.

1. 뇌 배양 세포에서 얻은 세포 펠렛을 0.3mL의 배지 A + 2% 정상 염소 혈청 또는 NGS로 재현탁합니다. 3 x 1.5 mL 튜브로 나눕니다: 하나는 염색되지 않은 세포로 관심 세포의 자가형광을 측정하기 위해, 두 번째는 2차 항체(1/200)로 2차 항체와 미세아교세포의 비특이적 결합을 측정하고, 세 번째는 테스트(4C4 마우스 단일클론 항체(미세아교세포 특이적)(1/20) + 2차 항체(1/200))로 나눕니다.
   1. 세포(모든 튜브)에 1%의 Low Endotoxin, Azide-Free(LEAF)를 추가하여 면역글로불린의 Fc 도메인과 CD16/CD32 상호 작용을 차단합니다. 5분마다 부드럽게 저어주면서 10분 동안 세포를 배양합니다.
   2. 4C4 항체(1/20)를 세포(튜브 3)에 추가하고 10분마다 부드럽게 교반하면서 30분 동안 배양합니다.
   3. 300g에서 튜브를 4°C에서 10분 동안 회전시킨 다음 상층액을 버립니다.
   4. 0.5mL의 배지 A + 2% NGS로 한 번 세척한 다음 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 튜브를 돌립니다.
   5. 세포 펠릿을 0.5ml의 Media A + 2% NGS로 재현탁하고 5분마다 부드럽게 교반하면서 10분 동안 LEAF로 세포를 배양합니다.
   6. 세포(튜브 2 및 3)에 2차 항체(1/200)를 추가합니다. 10분마다 부드럽게 저어주고 빛을 차단하면서 30분 동안 세포를 배양합니다.
   7. 튜브를 300g에서 4°C에서 10분간 회전시킨 후 상층액을 버립니다.
   8. 0.5mL의 배지 A + 2% NGS로 2회 세척한 다음 1mL의 배지 A + 2% NGS로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2. 35μm 세포 여과기 캡을 통해 세포 현탁액을 실행하고 빛으로부터 보호되는 얼음 위의 차가운 5mL 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 튜브로 옮깁니다.

2. 셀 정렬(FACS)

참고: 4°C에서 모든 단계를 수행하십시오.

1. FACS.
   를 사용하여 뉴런, 대식세포/미세아교세포 및 미세아교세포를 정렬합니다. 참고: 이 단계는 일반적으로 FACS 시설의 직원이 수행하며 설정은 사용하는 장비 유형에 따라 다릅니다.
   1. 각 FACS 튜브에 1μg/mL 농도의 DAPI를 첨가하여 죽은 세포를 라벨링합니다.
   2. FACS를 설정하고 모든 뇌 세포에서 뉴런, 대식세포/미세아교세포 또는 미세아교세포를 분류합니다. 크기와 입도의 기능에 따라 파편에서 세포를 분리한 다음 전방 산란(forward scatter)과 측면 산란(side scatter)으로 단일 세포를 게이트합니다. 살아있는 세포에서 DAPI 라벨링을 통해 죽은 세포를 제외합니다. 뉴런, 대식세포/미세아교세포 또는 미세아교세포를 각각의 양성 염색으로 식별합니다.
2. 얼음 위에 1mL의 얼음처럼 차가운 Media A + 2% NGS가 들어 있는 1.5mL 튜브에 세포를 수집합니다. 각 세포 유형에 대해 다른 튜브를 사용하십시오.
   1. 300 x g에서 튜브를 4°C에서 10분 동안 돌린 다음 상층액을 버립니다.
   2. 0.5mL의 Media A로 한 번 세척한 다음 최대 상층액을 버립니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
헤페스	지브코	제15630-056
D-포도당	시그마	G8644-100ML
HBSS 1배	지브코	제14170-088
일반 염소 혈청(NGS)	세포 신호 전달	5425초
35μm 셀 스트레이너 캡	BD (영어)	352235
FACS 튜브	BD (영어)	352063
저내독소, 아지드 무함유(LEAF)	바이오레전드	101321
Alexa Fluor 647 염소 안티 마우스 IgG(H+L)	생명 기술	A11008
안티 4C4	제공: Catherina Becker (University of Edinburgh)
FACS 분류기 FACSAria II	BD (영어)	QMRI, FACS 시설