CRISPR 매개 염기 편집 도구: 표적 염기 치환을 유도하는 게놈 편집 기술

초록

출처: See, J. E., et al. CRISPR 매개 염기 편집기를 사용한 BRCA1 변이체의 기능 평가. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 표적 뉴클레오티드 치환을 유도하기 위한 CRISPR 매개 사이토신 염기 편집기의 개념을 설명합니다.

프로토콜

1. CRISPR 매개 염기 편집 도구를 사용한 BRCA1 변이체 생성

참고: HAP1-BE3 세포주를 사용하지 않는 경우, BE3 인코딩 플라스미드 DNA는 BRCA1 표적 gRNA와 동시 transfection될 수 있습니다. BE3와 gRNA plasmid의 co-transfection과 비교하여, gRNA plasmid를 HAP-BE3 세포로 transfection하면 우리 손의 타겟 자리에서 최대 3배의 효율적인 염기 편집을 유도할 수 있습니다.

1. transfection 1일 전에 24-well plate의 웰당 5 x 10⁵ HAP1-BE3 세포(또는 co-transfection 방법의 경우 HAP1 세포)를 seed합니다. transfection시 적절한 밀도 (70 % –80 % confluence)에 도달하도록 세포를 배양합니다.
2. 제조업체의 프로토콜에 따라 구매한 transfection 시약(Table of Materials)을 사용하여 BRCA1 표적 gRNA를 transfection합니다. BRCA1 타겟 부위에서 C:G에서 T:A로의 변환을 유도하기 위해 1μg의 BRCA1 타겟 gRNA(co-transfection 방법의 경우 1μg의 BE3 인코딩 플라스미드 DNA 포함)를 사용합니다. 37 °C에서 세포를 배양하고 3-4일마다 계대배양합니다.
3. 염기 편집 효율을 분석하기 위해 transfection 후 3일, 10일 및 24일 후에 세포 pellet을 수확합니다(transfection 후 3일 동안의 샘플은 day 0 샘플로 재등급 분석됨).
4. 게놈 DNA 정제 키트(Table of Materials)를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.
   참고: DNA에 대한 시약의 다양한 비율로 transfection 조건을 최적화하는 것이 좋습니다. HAP1 transfection을 위한 최적의 조건은 우리 손의 DNA에 대한 시약의 4:1 비율입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
리포펙타민 2000	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11668027	트랜스펙션(Transfection) 시약
옵티-MEM	지브코	31985070	Transfection 재료
FuGENE HD 트랜스펙션 시약	프로메가	E2311	트랜스펙션(Transfection) 시약
Iscove의 변형된 Dulbecco의 매체	지브코	12440046	HAP1 세포용 배지
렌티카스9-블라스트	애드진	52962	lentiBE3 클로닝을 위한 플라스미드 DNA
DNeasy 혈액 및 조직 키트	키아겐	69504	게놈 DNA 전처리 키트

) 년 년