이미지 유도 로봇 세포 미세주입: 유기형 뇌 절편 배양에서 형광 표지된 다당류를 단일 신경 세포로 정밀하게 전달하기 위한 자동화된 고처리량 기술

초록

출처: Shull, G. et al. 로봇 미세주입을 사용한 뇌 절편의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 자기주입기를 사용하여 마우스 배아 뇌의 유기형 절편에 있는 피라미드 뉴런에 형광 표지된 다당류를 로봇으로 미세주입하는 방법을 시연합니다. 자기주입기는 관심 생체 분자를 단일 세포로 정밀하게 전달하기 위해 현미경에서 얻은 이미지를 활용하는 로봇 플랫폼입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 소프트웨어 설치

1. 지침에 따라 https://github.com/bsbrl/Autoinjector 에서 소프트웨어를 설치합니다.

2. 시약 및 피펫 준비

1. 아가로스: 200mL 유리병 2개에 각각 100mL의 세포 배양 등급 PBS에 광범위한 아가로스 3g과 저융점 아가로스 3g을 따로 용해하여 3% 아가로스를 준비합니다. 실온에서 최대 3개월까지 보관하세요.
2. Tyrode 용액 : 중탄산 나트륨 1g과 Tyrode 소금 (병 전체의 내용물 사용)과 13mL의 1M HEPES를 증류수 1L에 녹입니다. pH를 7.4로 조정합니다. 0.2μm 보틀탑 필터를 통해 용액을 여과합니다.
3. 슬라이스 배양 배지(SCM): 쥐 혈청 10mL, 2mM 글루타민 1mL, 페니실린-스트렙토마이신 1mL(100x), N-2 보충제 1mL(100x), B27 보충제 2mL(50x) 및 HEPES(pH 7.3) 완충액 1mL를 Neurobasal 배지 84mL에 추가합니다. 5mL의 SCM을 15mL 튜브에 분주합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
4. CO₂-독립 미세주입 배지(CIMM): 분말을 증류수 200mL에 용해시켜 5x DMEM 변형 저혈당 용액(페놀 레드 제외)을 준비합니다. 0.2μm 보틀탑 필터를 통해 용액을 여과합니다(DMEM 분말의 경우 전체 병의 내용물 사용). CIMM 100mL를 준비하려면 5x DMEM 변형 용액 20mL, HEPES 완충액 1mL, N2 보충제(100x) 1mL, B27 보충제 2mL(50x), 페니실린-스트렙토마이신 1mL(100x), 글루타민 2mM 1mL 및 증류수 74mL를 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
5. 재구성 완충액: 증류수에 262mM NaHCO₃, 0.05N NaOH, 200mM HEPES를 용해하여 재구성 완충액을 준비합니다. 병 상단 0.22μm 필터 시스템을 통해 멸균 유리병에 여과하여 용액을 멸균합니다. 500 μL의 재구성 완충액을 밀폐된 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
6. 미세주입 염료 스톡: 형광 표지된 덱스트란을 RNase free 증류수(최종 농도 10μg/μL)에 용해시킵니다. 5μL 분취액을 준비하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
7. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관(외경 1.2mm, 내경 0.94mm)에서 마이크로사출 피펫을 당깁니다. 먼지로부터 피펫을 보호하십시오. 피펫을 2-3일 이상 보관하지 마십시오. 이 실험에서 당기는 매개변수는 HEAT: 램프 온도 +1 – 5; 당기기 : 100; 벨: 110; 델: 100. HEAT 및 VEL은 피펫의 모양과 크기에 가장 큰 영향을 미치는 파라미터입니다.
   메모: 최적의 미세주입 피펫은 미세주입 중 세포 손상을 방지하기 위해 팁이 길고 유연합니다.

3. 조직 슬라이스 준비

1. 뇌 조직을 해부하기 전에 전자 레인지를 사용하여 3 % 넓은 범위의 아가로 로즈를 녹입니다. 아가로스가 굳어지지 않도록 하기 전에 37°C의 수조에 보관하여 매립하십시오. 피펫이 먼지로부터 보호되는지 확인하십시오. 피펫을 2-3일 이상 보관하지 마십시오.
2. SCM의 분취액을 해동하고 수조를 사용하여 10–12mL CIMM과 20mL의 Tyrode 용액을 37°C로 가열합니다.
3. 형광 추적자(Dextran-3000 또는 Dextran-10000-Alexa conjugated, 최종 농도 5–10 μg/μL)를 주입할 다른 화학 물질과 혼합합니다. microinjection 용액을 16, 000 x g에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 수집하고 새 튜브로 옮깁니다. 사용할 때까지 미세 주입 용액을 얼음에 보관하십시오.
4. E13.5–E16.5 마우스 배아의 머리를 사용하여 텔뇌의 유기형 조직 절편을 준비합니다. 피부를 제거하고 집게를 사용하여 두개골을 열고 정중선을 따라 움직입니다. 열린 두개골에서 배아 뇌를 해부하고 뇌의 복부 쪽에서 시작하여 뇌 조직을 덮고 있는 수막을 제거합니다. 절개된 뇌 전체를 37°C 가열 블록의 Tyrode 용액에 그대로 둡니다.
   메모: 3.4에 설명된 모든 해부 단계는 예열된 Tyrode 용액에서 수행해야 합니다.
5. 넓은 범위의 용융 아가로스를 일회용 임베딩 몰드에 붓습니다. 아가로스가 38-39 °C로 냉각되면 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌(최대 4개)를 조심스럽게 옮깁니다. 이 단계에서는 항상 절단 팁을 사용하십시오.
6. 조직을 건드리지 않고 주걱이나 Dumont #1 집게 한 쌍을 사용하여 조직 주위로 아가로스를 저어줍니다. 아가로스를 실온에서 굳히십시오. 아가로스가 굳으면 조직을 둘러싼 여분의 아가로스를 다듬습니다.
7. 버퍼 트레이에 PBS를 채웁니다. 트레이에 수직인 조직의 연저-꼬리 축으로 뇌의 방향을 잡습니다(뇌의 가장 중요한 부분을 나타내는 후각구를 랜드마크로 사용). 비브라톰을 사용하여 250μm 슬라이스를 자릅니다.
8. 3.5cm 페트리 접시에 예열된 미디어 2mL를 채웁니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이스 (10-15)를이 접시에 옮깁니다. 완료되면 슬라이스가 있는 페트리 접시를 슬라이스 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 슬라이스를 사용할 때까지 40% O₂ / 5% CO₂ / 55% N₂를 포함하는 가습 분위기에서 37°C로 유지하십시오.

4. 미세 주입

1. 컴퓨터, 현미경, 현미경 카메라, 매니퓰레이터, 압력 장비 및 압력 센서를 켭니다. GitHub에서 다운로드한 기본 폴더에서 "launchapp.py" 파일을 클릭하여 애플리케이션을 로드하고 팝업 화면에서 디바이스 설정을 지정합니다(설치 지침은 1.1단계 참조).
2. 피펫을 용액에 담그기 전에 원치 않는 막힘을 방지하기 위해 외부 압력을 가하십시오. 피펫에 압력을 가하려면 보상 압력 막대를 24–45%로 밀고 값 설정을 클릭합니다. 그런 다음 압력 센서에 표시된 대로 기계식 압력 밸브 손잡이를 1–2PSI(69–138mbar)로 돌려 압력을 충분한 압력으로 조정합니다.
3. 슬라이스를 예열 CIMM 3.5mL가 들어 있는 2cm 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시 중앙에 미세주입할 조각을 놓습니다. 페트리 접시를 예열된(37°C) 미세주입 단계로 옮깁니다.
4. 팁이 긴 플라스틱 피펫을 사용하여 1.4–1.6 μL의 미세주입 용액(3.3단계에서)을 미세주입 피펫에 로드합니다. 마이크로 주입 피펫을 피펫 홀더에 삽입합니다.
5. 현미경에서 가장 낮은 배율을 사용하여 절편에 초점을 맞추고 마이크로피펫을 이 시야(FOV)로 안내하여 절편 표적과 동일한 평면에 초점을 맞춥니다. 현미경의 출력을 카메라로 전환하여 애플리케이션에서 FOV를 확인합니다.
6. 인터페이스의 왼쪽 상단에 있는 확대 버튼을 클릭하여 장치 보정을 시작합니다. 배율을 선택하라는 창이 나타납니다. 10배 배율 또는 렌즈가 설정된 배율(예: 4x, 10x, 20x, 40x)을 선택하고 OK를 누릅니다. 소프트웨어는 내부 대물렌즈가 10x(가장 일반적인 대물렌즈 배율)라고 가정합니다.
7. 현미경의 마이크로미터 휠을 사용하여 피펫 팁의 초점을 다시 맞추고 커서로 피펫 팁을 클릭합니다. 그런 다음 1.1단계 버튼을 누르고 팝업 창에서 확인을 누릅니다. 피펫이 Y 방향으로 이동합니다. 피펫의 끝을 클릭하고 1.2 단계 버튼을 누릅니다. 마지막으로 피펫 각도 상자에 45를 입력하고 각도 설정을 누릅니다.
8. Automated microinjection controls 패널에 원하는 매개변수를 입력합니다. 정점 전구세포에 미세주입하는 경우 주입 거리를 20–40μm로, 깊이를 10–15μm로 설정합니다. 뉴런에 미세 주입하는 경우 표적에 따라 주입 거리를 기저 쪽에서 30-40μm, 깊이를 10-30μm로 설정합니다. 항상 속도를 100%로 설정하십시오. 값 설정을 클릭합니다.
   메모: 접근 거리는 피펫이 다음 주입 거리로 이동하기 전에 조직에서 빼내는 거리이고, 깊이는 미세 주입이 진행되는 조직 내부의 깊이이며, 간격은 순차적 주입 사이의 선을 따라 거리이고, 속도는 μm/s 단위의 피펫 속도입니다.
9. Draw edge 버튼을 클릭하고 팝업 창에서 원하는 궤적을 따라 커서를 드래그하여 주입 궤적을 정의합니다. 전구 줄기 세포를 미세주입하는 경우, 텔렌스팔론 표면의 복부 쪽을 표적으로 합니다. 피펫을 라인의 시작 부분으로 가져오고 피펫의 끝을 클릭합니다. Run trajectory(궤적 실행)를 클릭하여 마이크로주입을 시작합니다. 대상이 되는 모든 사출 평면에 대해 이 단계를 반복합니다(일반적으로 평면당 40-75번의 주입으로 3-4개의 평면에 대해 수행됨).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학 물질
아가로스, 저용융	칼 로스	고양이# 6351.2
아가로스, 와일드 레인지	시그마-알드리치	고양이 # A2790
Best-CA 221 접착제	최고의 Klebstoffe GmbH & Co.KG	고양이# CA221-10ml
B-27 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	고양이# 17504044
증류수
DMEM-F12, CO2 독립(페놀 레드 제외)	시그마-알드리치	고양이# D2906
DMEM-F12, CO2 독립(페놀 레드 포함)	시그마-알드리치	고양이# D8900
HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES 완충액)	칼 로스	고양이# 9105.3
L-글루타민, 200mM	써모 피셔 Sientific	고양이# 25030024
모위올 4-88	시그마-알드리치	고양이# 81381
N-2 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	고양이# 17502048
Neurobasal 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	고양이# 21103049
뉴클레아제가 없는 물	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	고양이# AM9937
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) 혼합, 50 리터
PBS (PBS)
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	고양이# 15140122
랫 세럼	찰스 리버 연구소
중탄산 나트륨 (NaHCO3)	머 크	고양이# 106323
수산화나트륨(NaOH)	머 크	고양이# 106482
티로드의 소금	시그마	Cat# T2145-10x1L)
설비
붕규산 유리 모세관, 외경 1.2mm x 내경 0.94mm	셔터 기기	고양이# BF-120-94-10
보틀탑 필터 시스템, 500 mL	코 닝	고양이# 430769
컴퓨터 PC
맞춤형 압력 장비		맞춤형 압력 장비
전자식 압력 조절기	파커 하니핀	카탈로그 # 990-005101-002
팔콘 튜브, 15 mL	코 닝	고양이# 430791
팔콘 튜브, 50 mL	코 닝	고양이# 430829
Flaming/ Brown 마이크로피펫 풀러	셔터 기기	고양이# P-97
겸자, Dumont no. 3	정밀 과학 도구	고양이# 11231-30
겸자, Dumont no. 5	정밀 과학 도구	고양이# 11255-20
겸자, Dumont no. 55	정밀 과학 도구	고양이# 11252-20
가열 블록	랩텍 인터내셔널	고양이 # 드라이 블록 Digi2
도립 형광 현미경	자이스	고양이# 액시오베르트 200
광원	올림푸스	고양이# 하이라이트 3100
수동 압력 조절기	맥마스터 카	고양이# 0-60 PSI 41795K3
Microloader 팁	에펜도르프	고양이# 5242956.003
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페트리 접시, 35 x 10mm	눕크	고양이# 153066
페트리 접시, 34 x 14 mm, Microwell no. 1.5 커버 유리 포함	매트텍	고양이# P35G-1.5-14-C
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온도계
3축 매니퓰레이터	센스 apex Inc	Cat# 트리축 uMP
비브라톰	라이카	고양이# VT1000s
전체 배아 배양 시스템 인큐베이터	이케모토 컴퍼니	고양이# RKI-10-0310
물목욕
소프트웨어 및 알고리즘
아두이노	아두이노
피지	RRID: SCR_002285
파이썬	Python 소프트웨어 기반	파이썬 2.7.12
선		RRID: SCR_013672