친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피: 친수성 비드를 사용하여 친수성 극성 분석물을 분리하는 기술

초록

출처: Liu, D., et al. 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글라이칸 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피를 사용하여 친수성 극성 화합물을 분리하는 원리를 보여줍니다. 이 기술은 N-글라이칸을 포함한 다양한 극성 분석물의 정제에 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 친수성 상호 작용 크로마토그래피 및 글라이칸 분석

1. UPLC 기기의 컨디셔닝 및 이동상 준비
   1. 용매 A: 100mM 포름산암모늄(pH = 4.4), 용매 B: 100% 아세토니트릴, 용매 C: 90% 초순수(10% 메탄올) 및 용매 D: 50% 메탄올(초순수)을 포함한 이동상을 준비합니다.
   2. 소프트웨어를 열어 이동상을 제어합니다.
   3. 0.2mL/분(50% 용매 B 및 50% 용매 C)의 유속으로 30분 동안 UPLC 기기를 세척한 다음 0.2mL/분(25% 용매 A 및 75% 용매 B)의 유속으로 20분 동안 밸런싱한 다음 0.4mL/분 밸런싱의 유속으로 세척합니다.
2. 2-아미노벤즈아미드(2-AB)로 사전 라벨링된 N-글라이칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물 25μL에 2:1 비율(v/v)로 용해시킵니다. 그런 다음 134 × g에서 5분(4°C) 동안 원심분리하고 라벨링된 N-글라이칸 10μL를 UPLC 기기에 로드합니다.
3. 75% - 62% 아세토니트릴의 선형 그래디언트로 0.4mL/분의 유속으로 25분 동안 라벨링된 N-글라이칸을 분리합니다. 그런 다음 60°C에서 UPLC에서 dextran calibration ladder/glycopeptide column을 사용하여 분석 실행을 수행합니다(여기서 샘플은 주입 전에 4°C로 보관됨).
4. 각각 330nm 및 420nm의 여기파 및 방출파 길이에서 N-글라이칸 형광을 검출합니다.
5. 피크 위치와 머무름 시간을 기준으로 글라이칸을 적분합니다.
6. 각 글라이칸 피크(GP)/모든 글라이칸 피크(GP)의 상대값(백분율, %)을 GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100 등과 같이 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-아미노벤즈아미드, 2-AB	Sigma, 중국
아세토니트릴	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국
포름산암모늄	베이징 Minruida 기술 Co., 주식 회사.
Dextran 검량 래더/글리코펩타이드 컬럼	Watts technology Co., Ltd, 중국
임파워풀 3.0	Waters technology Co., Ltd, 미국
GlycoProfile 2-AB 라벨링 키트	Sigma, 중국
메탄올	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국
Milli-Q 순수 유량계	Millipore Co., Ltd, 미국	202-2AB
액체 총을 옮기십시오	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, 중국	어드밴티지 A10
초저온 냉장고	Thermo Co., Ltd, 미국	PB-10
초고성능 액체 크로마토그래피	Watts technology Co., Ltd, 중국
진공 펌프	Watts technology Co., Ltd, 중국	4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl