역상 고성능 액체 크로마토그래피: 마우스 간에서 분리된 형광 표지 및 유도체화된 시알산의 정량을 위한 강력한 방법

초록

출처: Cao, C. et al. 야생형 및 CMAH 녹아웃 마우스의 간 및 우유 샘플에서 시알산의 결정.J. Vis. 특급(2017년)

이 비디오에서는 형광 검출을 돕기 위해 적절한 형광 표지 시약으로 유도체를 추출한 후 고성능 액체 크로마토그래피, HPLC를 사용하여 시알산, N-아세틸뉴라민산 및 N-글리콜릴뉴라민산을 검출하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 시알산의 형광 유도체화

1. 증류된 H₂O 10mL에 o-페닐렌디아민 100mg과 아황산수소나트륨 208mg으로 구성된 OPD 용액 10mL를 준비합니다.
2. 시알산 샘플에 20μL의 OPD 용액을 추가합니다. 30초 동안 격렬하게 소용돌이치고 어두운 곳에서 80°C에서 4시간 동안 샘플을 배양합니다(즉, 마이크로튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다).
3. 샘플을 5분 동안 식힌 후 증류된 H₂O 80μL를 넣고 1분 동안 14,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
4. 상층액에서 80 μL를 300 μL 고회수율 HPLC 바이알로 전달합니다. 유도체화된 시알산 샘플은 최대 1주일 동안 4-6°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 시알산 유도체의 HPLC 분석

1. 온라인 형광 검출기에 연결된 표준 HPLC 시스템을 사용하여 샘플을 분석합니다.
2. 분석을 위해 표준 치수가 길이 250mm, 직경 4.6mm인 역상 C18 컬럼을 사용합니다.
3. 200mL의 원액을 800mL의 LCMS 등급 물(LCMS - 액체 크로마토그래피 질량 분석법)로 희석하여 용매 A를 준비합니다. 원액 자체는 다음과 같이 제조할 수 있습니다.
   1. 포름산 46g을 LCMS 등급 H₂O 800mL에 첨가합니다.
   2. 수산화암모늄 용액(puriss. p.a.)을 적가하여 pH를 4.5로 조정합니다.
   3. 용매를 측정 실린더로 옮기고 LCMS 등급 H₂O로 최대 1,000mL를 채웁니다. 이 원액은 4-6°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
4. 용매 B의 경우 LCMS 등급 아세토니트릴을 사용합니다.
5. 다음 그래디언트 용리를 사용하여 1mL/min 유속으로 시알산 유도체를 분리합니다.
   1. 용매 A에 혼합된 용매 B의 10%를 첨가하는 것으로 시작합니다.
   2. 0분에서 15분까지 선형 그래디언트를 갖는 용매 B의 비율을 60%까지 점진적으로 증가시킵니다.
   3. 15분에서 16분으로, 선형 그래디언트로 용매 B의 비율을 60%에서 90%로 급격히 증가시킵니다. 이렇게 하면 HPLC 컬럼의 세척이 시작됩니다.
   4. HPLC 컬럼을 추가로 세척하려면 16분에서 18분 사이에 용매 B의 수준을 90%로 유지한 후 18분에서 19분 사이에 용매 B의 수준을 다시 10%로 점차적으로 낮춥니다.
   5. HPLC 컬럼을 19분에서 24분 사이에 10% B의 시작 조건으로 재평형화합니다.
6. 50μL의 시료를 HPLC 시스템에 주입합니다.
7. 373/448 nm의 형광 검출기 여기/방출 파장을 사용하여 용리액을 모니터링하고 유도체화된 시알산은 9분(Neu5Gc-OPD의 경우) 및 10분(Neu5Ac-OPD의 경우)의 대략적인 머무름 시간으로 예상할 수 있습니다.
8. Neu5Ac(A_Neu5Ac) 및 Neu5Gc(A_Neu5Gc)의 형광 피크 면적에서 Neu5Gc(F,_Neu5Gc)의 상대적인 양을 다음과 같이 계산합니다.
   f_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc). 동형접합 Cmah 녹아웃 마우스의 우유 및 간 샘플의 경우 F_Neu5Gc는 0%여야 하는 반면, 이형접합 및 야생형 마우스의 F_Neu5Gc 값은 마우스 연령 및 조직 유형(2%에서 >90% 사이)에 따라 크게 다를 수 있으며 예상 오차 범위는 ±12%입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학 물질
N-아세틸뉴라민산	시그마	A0812
N-글리콜릴뉴라민산	시그마	50644	분취액 1mg이면 충분합니다.
O-페닐렌디아민	시그마	694975
아황산수소나트륨	J&K 사이언티픽 주식회사	75234
HPLC 분석
고회수율 HPLC 바이알	애질런트 테크놀로지스	#의 5188-2788
HPLC 시스템	시마즈	넥세라
HPLC용 형광 검출기	시마즈	RF-20축
HPLC 컬럼	페노메넥스	하이퍼클론 ODS	250 x 4.6 밀리미터
LCMS 등급 H2O	머크 밀리포어	#WX00011
LCMS 등급 아세토니트릴	머크 밀리포어	#100029	하이퍼그레이드
수산화암모늄 용액	플루카	#의 44273	Puriss. 아빠