헤드스페이스 가스 크로마토그래피: 제브라피시 배아의 에탄올 농도를 평가하는 기법

초록

출처: Lovely, C. B. et al. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용한 제브라피시 배아의 에탄올 수준 정량화. J. Vis. 특급 (2020).

이 동영상은 헤드스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아의 에탄올 농도를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 휘발성 유기 화합물의 정성 및 정량 분석에 유용한 도구를 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 물 치환을 이용한 배아 부피 측정

참고: 이 프로토콜에서는 24시간 수정(hpf) 배아(그림 1)가 사용됩니다. 부피 측정에 사용된 배아는 에탄올 분석에 사용되지 않습니다.

1. 250μL 부피로 표시된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 10개의 배아와 배아 외 유체를 넣습니다(그림 2A). 250μL 주입 라인에 물을 추가합니다(그림 2B에서 염색된 물이 있는 샘플 참조).
2. 1.1단계를 반복하여 맥락막이 제거된 배아를 위한 용기를 설정합니다.
   1. 융모막을 제거하려면 융모막에 있는 배아를 100mm 페트리 접시에 넣고 배아 배지에 2mg/mL의 프로테아제 칵테일을 넣고 실온(RT)에서 10분 동안 놓습니다. 몇 분에 한 번씩 배아를 부드럽게 휘젓아 융모막을 끊습니다.
   2. 모든 배아가 융모막에서 벗어나면 프로테아제 칵테일/배아 배지에서 제거된 배아를 제거하고 새 배아 배지가 있는 새 100mm 페트리 접시에 넣어 배아를 세척합니다. 이 세탁 단계를 1회 더 반복합니다(총 2회 세탁). 배아를 신선한 100mm 페트리 접시에 옮깁니다.
3. 배아를 손상시키지 않고 가능한 가장 작은 팁을 사용하여 p200 마이크로피펫터(그림 2C)를 사용하여 배아 주변의 모든 액체를 조심스럽게 제거하고 <0.1mg 정밀도의 저울로 물의 무게를 잰다. 10개 배아 샘플의 부피를 측정하려면 250μL에서 제거한 물의 무게/부피(물 1mL = 물 1g)를 뺍니다. 단일 배아의 부피를 측정하려면 250μL와 제거된 물의 무게 사이의 차이를 10.
   로 나눕니다.
   

2. 배아를 에탄올로 처리

1. 짝짓기 탱크에서 배아를 모아 표준 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 단일 페트리 접시당 100개 이하의 배아를 계산하고 28.5°C에서 배양합니다.
   메모: 융모막을 제거해야 하는 경우(1.2단계) 에탄올을 추가하기 전에 제거해야 합니다.
2. 6hpf에서 배아 배지 또는 배아 배지 + 1% 에탄올(v/v)을 사용하여 새로운 표준 100mm 페트리 접시에 최대 100개의 배아를 추가합니다. 뚜껑을 덮되 페트리 접시를 밀봉하지 마십시오. 배아를 28.5°C로 설정된 저온 인큐베이터에 18시간 동안 또는 배아가 24hpf의 발달 시점에 도달할 때까지 놓습니다.

3. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 위해 배아를 처리하기 전에 워크플로우 준비

1. 물에 5M NaCl 용액을 넣고(샘플 튜브당 450μL 필요) 모든 단백질을 변성시키고 에탄올 대사를 방지합니다. 프로테아제 칵테일을 배아 배지에서 2mg/mL의 농도로 만듭니다.
2. 각 샘플에 대해 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 2mL 가스 크로마토그래프 바이알에 라벨을 부착합니다. 아래에 설명된 에탄올 표준물질에 대한 추가 2mL 가스 크로마토그래프 바이알과 공기, 물 및 5M NaCl/프로테아제 칵테일 블랭크에 라벨을 부착합니다.
3. 3개의 p200 마이크로피펫터를 2개는 50 μL로, 세 번째는 200 μL로 설정합니다. p1000 마이크로파이펫은 450 μL로, p2 마이크로파이펫은 2 μL로 설정합니다. 페트리 접시에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 배아를 옮기는 데 사용되는 유리 피펫의 경우, 피펫 팁을 화염에 빠르게 통과시켜 배아를 피펫으로 끌어들일 때 배아가 손상되지 않도록 가장자리를 매끄럽게 합니다.

4. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 위한 배아 처리

참고: 융모체에 있는 배아와 이전에 융모막에서 제거된 배아는 모두 희석 계수 계산의 일관성을 위해 동일하게 취급됩니다.

1. 50 μL로 설정된 두 개의 p200 마이크로피펫터를 사용하여 50 μL의 프로테아제 칵테일 용액을 한 용액에 주입하고 50 μL의 물을 두 번째 용액에 주입합니다.
2. 유리 피펫과 마이크로피펫터를 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 10개의 배아(2.2단계)를 빠르게 넣고 캡을 닫습니다(그림 2A 참조). 테스트할 모든 샘플, 대조군 및 에탄올 처리된 배아에 대해 반복합니다.
3. 200 μL로 설정된 p200 마이크로파이펫터를 사용하여 캡을 빠르게 열고 모든 잔류 배아 배지를 제거합니다(그림 2C 참조). 50μL의 물이 들어있는 피펫을 튜브에 빠르게 넣고 빠르지만 부드럽게(배아를 손상시키지 않도록) 물을 추가한 다음 제거합니다. 대기 중인 피펫터에서 50 μL의 프로테아제 칵테일 용액을 빠르게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2D).
   메모: 이 프로세스를 한 번에 하나의 샘플로 수행합니다.
4. 프로테아제 칵테일이 융모체를 분해할 수 있도록 샘플을 10분 동안 RT에 두십시오. 그런 다음 450μL의 5M NaCl을 빠르게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다(그림 2E). 10분 동안 샘플을 볼텍스합니다. 프로세스 속도를 높이려면 여러 샘플을 동시에 소용돌이치도록 믹서를 설정하십시오.
   참고: 24hpf보다 오래된 배아가 있는 튜브에 소량(~100μL)의 실리카 비드 혼합물(2가지 크기, 0.5mm 및 1mm 비드)을 추가합니다. 더 오래된 배아에서 노토코드는 균질화된 기간에 관계없이 그대로 유지됩니다.
5. 10분 동안 균질화한 후 2μL의 균질화된 배아 상등액을 빠르게 제거하고 기체 크로마토그래프 바이알에 첨가합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 바이알을 빠르게 밀봉합니다.

5. 배지 및 에탄올 표준물질 준비

1. 배지 표준물질을 준비하려면 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액으로 배지를 10배 희석합니다. 각 시료 2μL를 기체 크로마토그래프 바이알에 넣고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.
2. 에탄올 표준물질을 준비하려면 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액에 100% 에탄올을 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40mM 농도로 연속 희석합니다. 각 표준물질 2μL를 가스 크로마토그래프 바이알에 첨가하고 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 밀봉합니다.

6. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피 준비

참고: 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피는 분리가 아닌 에탄올 수준을 정량화하는 데 사용됩니다.

1. 오토샘플러의 히터를 58°C로 설정하고 켭니다. 히터가 58°C에 도달하도록 하고 가스 크로마토그래프에 공급되는 공기 및 수소 가스 라인을 켭니다(에탄올을 정량화하는 데 사용되는 화염 이온화의 경우).
   참고: psi는 제조업체의 사양에 따라 크로마토그래프가 올바르게 작동하도록 설정되어야 합니다. 헬륨 라인이 켜져 있고 적절한 psi로 설정되어 있는지 확인하십시오.
2. 중격의 경우 주입된 샘플의 수가 >100이 아닌지 확인하십시오. 주입 섬유의 경우 주입된 샘플의 수가 >500.
   가 아닌지 확인하십시오. 참고: 둘 중 하나라도 주입 횟수를 초과하면 테스트 샘플을 실행하기 전에 교체해야 합니다.
3. 해석 소프트웨어를 켜고 워크스테이션이 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 실험실/부서 표준에 따라 모든 데이터를 저장합니다. 실행할 샘플에 대한 새 샘플 목록을 만듭니다.
4. 시작 방법을 시작하고 s를 실행하기 전에 화염 이온화 검출기가 안정화될 때까지 기다립니다. 안정되면 소프트웨어 시작 방법을 실행하여 광섬유를 청소합니다.

7. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용한 시료 측정

1. startup Method가 완료되면 샘플 목록에서 샘플당 1개의 새 라인을 만듭니다. 분석 소프트웨어의 방법 메뉴에서 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run을로드합니다. 표본 목록의 각 표본에 대한 METH.
   1. 공기, 물, 5M NaCl/프로테아제 칵테일 블랭크부터 시작하여 샘플 목록을 작성합니다. 그런 다음 0.3125mM에서 40mM까지 순서대로 표준을 입력합니다. 공기, 물 및 5M NaCl/프로테아제 칵테일 블랭크를 두 번째 라운드로 사용하여 표준을 따릅니다.
   2. 테스트할 모든 균질화된 배아 상등액 샘플을 가장 낮은 예측 에탄올 농도에서 가장 높은 예측 에탄올 농도까지 입력합니다. 공기, 물 및 5M NaCl / 프로테아제 칵테일 블랭크의 세 번째이자 마지막 라운드를 입력하여 끝냅니다.
2. 가스 크로마토그래프 바이알을 샘플이 입력된 순서대로 자동 시료 주입기에 추가합니다. 샘플을 10-15분 동안 데우십시오. 소프트웨어에서 샘플 실행을 시작합니다.
3. 모든 샘플과 최종 블랭크가 실행된 후 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기 모드를 실행하여 소프트웨어에서 종료 방법을 활성화합니다. 필로폰. 샘플 실행 중에 수집된 모든 데이터를 백업합니다. 오토샘플러 히터, 수소 탱크, 크로마토그래프 온도가 30°C에 도달한 후에만 공기 탱크의 순서로 장비를 끕니다. 왁스 컬럼을 보존하기 위해 헬륨 탱크를 켜 두십시오.

8. 시료 에탄올 피크 통합 및 시료 농도 분석

참고: 8.3 이후의 모든 값은 모든 방정식이 미리 채워진 엑셀 파일에서 계산되었습니다.

1. 셧다운 분석법이 완료되면 Open chromatogram(크로마토그램 열기)을 클릭합니다. 결과가 포함된 폴더를 엽니다. 샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다.
2. 결과에서 올바른 피크가 적분되었는지 확인합니다(에탄올 피크는 2와 2.5 사이). 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.
3. 에탄올 표준물질의 피크 높이를 그래프에 플로팅합니다. 에탄올 표준에 대한 기울기, Y 절편 및 R² 값을 계산합니다(R²는 >0.99여야 함).
   메모: 이 값은 샘플 피크 높이에서 에탄올 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
4. 각 샘플에 대해 에탄올 표준물질의 Y 절편에서 샘플의 피크 높이를 뺍니다. 이 값을 에탄올 표준물질의 기울기로 나누어 GC 바이알의 각 샘플에 대한 에탄올 값을 구합니다.
   
5. 배아의 에탄올 농도를 계산하려면 먼저 각 샘플의 희석 계수를 계산하십시오. 이 프로토콜의 1.3단계에서 계산된 부피 측정값을 사용하여 부피 측정값에 500μL를 더한 값으로 나눕니다. 이는 배아 처리(단계 4.3 및 4.4) 중에 각 샘플에 추가된 5M NaCl/프로테아제 칵테일 용액을 나타냅니다.
   
6. 이 샘플 희석 계수를 사용하여 각 샘플에 대한 샘플 에탄올 값을 곱합니다. 결과는 mM 농도입니다. 배지 에탄올 값에 10.
   의 희석 계수를 곱하여 배지 참조 샘플을 계산합니다.
   

결과

그림 1 : 융모막 내부의 24시간 수정(hpf)에 있는 배아의 이미지. 배아와 난황은 배아 외 액체로 둘러싸여 있으며, 모두 융모막 내부에 있습니다.

그림 2 : 배아의 부피를 측정하고 분석을 위해 배아를 처리하는 프로토콜. (A) 250μL 부피로 표시된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 이식된 24hpf 배아 10개. (B) 배아에 물이 채워진 마이크로 원심분리 튜브(물은 염색되어 250μL 표시에서 더 쉽게 볼 수 있음). (C)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오토샘플러, CP-8400	바리안		기체 크로마토그래프 자동시료주입기
에탄올	디콘 랩스	2701
폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡이 있는 가스 크로마토그래프 바이알 2mL	애질런트	8010-0198	세척 후 바이알은 재사용할 수 있지만 캡/격막은 재사용할 수 없습니다.
가스 크로마토그래프, CP-3800	바리안
헬륨			대학과 계약에 의해 제공
HP Innowax 캐필러리 컬럼	애질런트	19095N-123I	30m x 0.53mm x 1.0μm 필름 두께
하이드로젠			대학과 계약에 의해 제공
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	피셔 사이언티픽	2682002
마이크로피펫 팁 10 μL	피셔 사이언티픽	13611106
마이크로피펫 팁 1000 μL	피셔 사이언티픽	13611127
마이크로피펫 팁 200 μL	피셔 사이언티픽	13611112
Pipetman L p1000L 마이크로피펫	길슨	FA10006M
Pipetman L p200L 마이크로피펫	길슨	FA10005M
Pipetman L p2L 마이크로피펫	길슨	FA10001M
폴리테트라플루오로에틸렌/실리콘 격막 및 플라스틱 캡	애질런트	5190-7021	가스 크로마토그래프 바이알용 교체용 캡/격막
고체상 미세추출 섬유 어셈블리 Carboxen/Polydimethylsiloxane	밀리포어 시그마	57343-유	교체용 섬유
스타 크로마토그래피 워크스테이션	바리안		크로마토그래피 소프트웨어
Thermogreen Low Bleed (LB-2) 격막	밀리포어 시그마	23154	교체용 주입구 격막

년 년