방법 논문

파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

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2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Konovalova, S. 블루 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역 블로팅을 사용하여 배양된 인간 세포의 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 분석. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 미토콘드리아 호흡 단백질 복합체를 본래 접혀 기능적으로 활성화된 상태에서 분석하기 위해 blue native PAGE라는 전기영동 기술을 시연합니다. 음이온성 Coomassie blue 염료는 단백질 복합체를 음전하로 띠게 하여 크기와 구조에 따라 분리할 수 있습니다.

프로토콜

1. 버퍼 및 솔루션 준비

참고: 프로토콜에 사용된 모든 버퍼와 솔루션은 표 1에 요약되어 있습니다. 주어진 부피의 버퍼는 10개의 샘플을 준비하고 실행하기에 충분합니다. 모든 버퍼는 최대 1년 동안 +4°C에서 보관할 수 있습니다.

  1. 증류수(dH2O)에 1.5M 아미노카프로산, 150mM 비스트리스를 함유한 3x 겔 버퍼 20mL를 준비합니다. pH를 7.0으로 조정합니다.
  2. dH2O에 2 M 아미노카프로산 10 mL를 준비합니다.
  3. 3x 겔 완충액 0.5mL, 2M 아미노카프로산 0.5mL 및 500mM EDTA 4μL를 결합하여 미토콘드리아 완충액 1mL를 준비합니다.
  4. dH2O에서 15mM의 Bis-tris와 50mM의 트리신을 포함하는 1,000mL의 음극 완충액을 준비합니다.pH를 7.0으로 조정합니다.
    1. 200mL의 음극 완충액에 0.04g의 Coomassie blue G-250을 첨가하여 200mL의 청색 음극 완충액을 준비합니다.
  5. dH2O에 50mM Bis-tris를 포함하는 1,000mL의 양극 완충액을 준비하고 pH를 7.0으로 조정합니다.
  6. dH2O에서 750mM 아미노카프로산과 5% Coomassie blue G-250을 함유한 2.5mL의 샘플 버퍼를 준비합니다.

2. 미토콘드리아 용해물의 준비

  1. 채취 전날 세포를 플레이트에 넣습니다. HEK293 또는 143B 세포의 경우, 10% 소 태아 혈청, 1% L-글루타민, 100mg/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신이 함유된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)를 사용합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 +37°C의 5% CO2 가습 분위기에서 세포를 성장시킵니다. 채취 당일에 각 샘플에 대해 최소 500,000개의 세포가 있는지 확인합니다.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 부드럽게 씻습니다. 플레이트에서 세포를 분리하지 마십시오. 세포를 긁어내고 800 x g에서 +4 °C에서 10분 동안 펠릿화합니다.
  3. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포 펠릿을 두 번 세척하고 2.2단계와 같이 원심분리기를 합니다. 상용 키트를 사용하여 Bradford 방법으로 단백질 농도를 측정합니다. +4 °C에서 10분 동안 800 x g에서 셀을 펠렛화합니다
    메모: 세포 수집 후 +4 °C에서 모든 단계를 수행하고 와류가 발생하지 않도록 합니다.
  4. PBS 20mL에 100x 프로테아제 억제제 200μL를 첨가하여 프로테아제 억제제가 포함된 PBS 20mL를 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 프로테아제 억제제로 PBS의 세포를 최종 단백질 농도 5mg/mL로 재현탁합니다.
    1. 세포를 5mg/mL로 재현탁하는 데 필요한 프로테아제 억제제로 PBS의 부피를 계산하려면 각 샘플의 단백질 양을 계산하십시오. 이 계산을 위해 2.3단계에서 측정한 단백질 농도와 2.3단계에서 세척한 후 세포를 재현탁하는 데 사용된 PBS의 부피를 사용합니다.
  5. 프로테아제 억제제가 포함된 PBS에 3.3mM 디지토닌 1mL를 준비합니다. 3.3mM 디지토닌을 1.65mM의 최종 농도에 추가합니다. 잘 섞어 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
    1. 프로테아제 억제제가 포함된 PBS에 3.3mM 디지토닌 1mL를 준비하려면 침전물이 보이지 않을 때까지 100°C에서 PBS 1mL에 디지토닌 4mg을 용해하고 즉시 얼음에서 식힙니다. 10μL의 100x 프로테아제 억제제를 1mL의 디지토닌 용액에 추가합니다.
      메모: digitonin.
      의 새 용액만 사용하십시오. 주의: 디지토닌은 독성이 있습니다! 안면 마스크, 장갑 및 실험실 가운을 사용하십시오.
  6. 1.5mL의 최종 부피에 proteinase inhibitor(2.4단계에서 준비)가 포함된 PBS를 추가합니다. +4 °C에서 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리기. 상층액을 제거합니다. 이 단계에서는 미토콘드리아가 펠릿화됩니다.
  7. 미토콘드리아 완충액에 미토콘드리아 펠릿을 재현탁합니다. 미토콘드리아 완충액의 부피는 2.4단계에서 PBS 부피의 절반입니다.
  8. 프로테아제 억제제를 함유한 PBS에서 신선한 10% 라우릴 말토시드를 준비합니다(2.4단계에서 준비). 10개의 샘플에 1mL이면 충분합니다. 최종 농도 1%에 10% 라우릴 말토사이드를 추가합니다. 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다(이 단계는 최대 몇 시간까지 길어질 수 있음).
  9. +4 °C에서 20분 동안 20,000 x g에서 원심분리기.상층액을 새 튜브에 모읍니다. 키트를 사용하여 Bradford 방법으로 단백질 농도를 측정합니다. 2.8단계에서 사용된 lauryl maltoside 부피의 절반인 샘플 완충액을 추가합니다. 샘플은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. BN-PAGE용 그라디언트 젤 준비

  1. BN-PAGE용 그라디언트 젤을 실온에서 붓습니다. 그래디언트 메이커를 교반 플레이트에 놓고 유연한 튜브를 사용하여 연동 펌프에 연결합니다. 바늘이 있는 주입 세트를 튜브에 부착합니다. 자석 교반기를 그라디언트 메이커의 근위 챔버에 놓습니다. 최대 펌프 속도로 10분 동안 dH2O로 튜브를 세척합니다.
  2. 튜브와 그라디언트 메이커를 비우십시오. 피펫을 사용하여 그래디언트 메이커의 챔버 사이의 채널에 남아 있는 dH2O를 제거합니다. 밸브로 채널과 튜브를 닫습니다.
  3. 주조 프레임과 클램프를 사용하여 바닥에 구멍이 있는 홀더에 두 개의 유리판을 조립하고 스탠드에 놓습니다. 물 균형이 있는 직선 표면에 다소 있는지 확인하십시오. 유리판 사이에 튜브에 연결된 바늘을 놓습니다.
  4. 6% 및 15% 겔 용액을 준비합니다(표 2). 얼음 위에 보관하십시오. 과황산암모늄(APS)과 테트라메틸렌디아민(TEMED)을 마지막으로 추가합니다(중합 시작). 기포가 생기지 않도록 부드럽게 섞습니다.
  5. gradient-gel-mixer 튜빙 챔버의 근위부 끝에는 6% gel을, 말단 끝에는 15% gel을 로드합니다. 젤의 총 부피는 유리판 사이의 분리 젤의 부피와 같아야 합니다. 따라서 8.3cm x 7.3cm 크기의 겔 1개에 대해 2.6mL의 6% 겔과 2.1mL의 15% 겔을 그라디언트 겔 믹서에 사용합니다.
  6. 마그네틱 교반기를 켜고 그라디언트 메이커의 챔버 사이의 튜브와 채널을 엽니다. 즉시 연동 펌프를 5mL/분으로 켭니다. 유리판을 채우고 거품이 젤에 들어가지 않도록 하십시오. 튜브에 젤이 없으면 바늘을 제거하십시오.
  7. 젤에 dH2O를 부드럽게 오버레이합니다. 중합을 위해 젤을 최소 1시간 동안 실온에 보관하십시오.
  8. 겔을 주입한 직후, 그래디언트 챔버에 dH2O를 채우고 연동 펌프를 최대 속도로 사용하여 튜브를 세척합니다. 두 개 이상의 젤을 준비할 때는 항상 중간에 시스템을 청소하십시오.
  9. 3x 젤 버퍼 3mL를 혼합하여 1x 젤 버퍼를 준비하고 dH2O 6mL를 추가합니다. 여과지로 젤 표면에서 dH2O를 부드럽게 제거합니다. 1x 젤 버퍼로 젤 표면을 씻습니다. 여과지가 있는 1x 젤 버퍼를 부드럽게 제거합니다.
    1. 젤의 여과지에서 섬유를 피하십시오. 이를 위해 가위로 종이를 작은 조각으로 자르되 종이를 찢지 마십시오.
  10. 빗을 유리판 사이에 놓되 빗 아래에 스태킹 젤을 부을 수 있도록 완전히 담그지 마십시오. 4% 스태킹 젤을 준비합니다(표 2). APS와 TEMED는 쉽게 중합을 시작하므로 마지막에 추가합니다. 기포를 피하면서 부드럽게 섞습니다.
  11. 빗 아래에 거품이 생기지 않도록 스태킹 젤을 바르고 빗을 완전히 담그십시오. 스태킹 젤이 최소 30분 동안 중합되도록 합니다. 빗을 제거하고 피펫을 사용하여 1x 젤 버퍼로 웰을 세척합니다.
    1. 중합 후 겔은 +4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 젤을 보관하려면 젤이 건조되지 않도록 dH2O와 플라스틱 필름을 적신 종이로 젤을 감쌉니다.

4. 청색 천연 젤 전기 이동법

참고: OXPHOS 복합체의 분해를 방지하려면 +4°C에서 전기영동을 실행합니다. 미리 냉각된 버퍼를 사용합니다.

  1. 파란색 음극 버퍼가 있는 젤 카세트를 웰 바닥까지 로드합니다. 샘플 로딩은 카세트가 맨 위로 채워지지 않을 때 더 쉽습니다. 파란색 음극 완충액으로 웰을 세척한 다음 피펫을 사용하여 파란색 음극 버퍼로 웰을 채웁니다.
  2. 샘플(단백질 5-30μg)을 웰에 로드합니다. 겔 카세트를 파란색 음극 버퍼로 상단까지 부드럽게 채우고 탱크를 양극 버퍼로 채웁니다.
  3. 40V의 일정한 전압에서 15분 동안 젤을 실행합니다. 그런 다음 전압을 80V로 높이고(또는 6mA의 정전류를 사용) 10mA를 초과하지 마십시오. 염료가 젤 길이의 2/3에 도달할 때까지 젤을 실행합니다.
  4. 파란색 음극 완충액을 음극 완충액으로 교체하고 염료 선단이 다 떨어질 때까지 전기영동을 계속합니다. 전체적으로 전기 영동에는 약 3 시간이 걸립니다.
  5. 유리판을 회수하고 반건조 블로팅을 통해 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 전달합니다.

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결과

표 1: BN-PAGE에 사용되는 버퍼 및 솔루션

합니다.
버퍼 또는 용액구성처방
3 x 젤 버퍼1.5M 아미노카프로산아미노카프로산 3.94 g
150mM 비스트리스비스트리스 0.63 g
dH2영형dH2O를 20 mL에 첨가

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공개 사항

선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mm 셀 플레이트써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific130182
40% 아크릴아미드/Bis 37.5:1바이오 라드Tel.: 161-0148
아미노카프로산시그마A2504 (영어
과황산암모늄시그마A3678
비스트리스시그마B7535
Bradford 단백질 분석 키트바이오라드5000006
셀 스크레이퍼어부11597692
쿠마시 블루 G250(세르바 블루 G)세르바35050
디지토닌시그마D141
DMEM을 참조하십시오.론자12-614층/12
에디타생명 기술제15575-038
FBS(증권 시세생명 기술10270106
소 태아 세럼생명 기술10270106
글리세롤시그마G5516
그라디언트 메이커바이오 라드1654120
라우릴 맥아시드(n-Dodecyl β-D-maltoside)시그마D4641
L-글루타민생명 기술25030024
L-글루타민지브코25030
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)시그마T9281
PBS (PBS)생명 기술BE17-516F
페니실린/스트렙토마이신론자17-602E
페니실린/스트렙토마이신지브코15140
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프로테아제 억제제써모 사이언티픽(Thermo Scientific10137963
트랜스 블롯 터보 미니 PVDF바이오라드1704156
트리신시그마T9784
트립신-EDTA지브코15400054
수직 전기 영동 장치바이오라드1658004
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