파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

초록

출처: Konovalova, S. 블루 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역 블로팅을 사용하여 배양된 인간 세포의 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 분석. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 미토콘드리아 호흡 단백질 복합체를 본래 접혀 기능적으로 활성화된 상태에서 분석하기 위해 blue native PAGE라는 전기영동 기술을 시연합니다. 음이온성 Coomassie blue 염료는 단백질 복합체를 음전하로 띠게 하여 크기와 구조에 따라 분리할 수 있습니다.

프로토콜

1. 버퍼 및 솔루션 준비

참고: 프로토콜에 사용된 모든 버퍼와 솔루션은 표 1에 요약되어 있습니다. 주어진 부피의 버퍼는 10개의 샘플을 준비하고 실행하기에 충분합니다. 모든 버퍼는 최대 1년 동안 +4°C에서 보관할 수 있습니다.

1. 증류수(dH_2O)에 1.5M 아미노카프로산, 150mM 비스트리스를 함유한 3x 겔 버퍼 20mL를 준비합니다. pH를 7.0으로 조정합니다.
2. dH₂O에 2 M 아미노카프로산 10 mL를 준비합니다.
3. 3x 겔 완충액 0.5mL, 2M 아미노카프로산 0.5mL 및 500mM EDTA 4μL를 결합하여 미토콘드리아 완충액 1mL를 준비합니다.
4. dH₂O에서 15mM의 Bis-tris와 50mM의 트리신을 포함하는 1,000mL의 음극 완충액을 준비합니다.pH를 7.0으로 조정합니다.
   1. 200mL의 음극 완충액에 0.04g의 Coomassie blue G-250을 첨가하여 200mL의 청색 음극 완충액을 준비합니다.
5. dH₂

결과

표 1: BN-PAGE에 사용되는 버퍼 및 솔루션

합니다.

버퍼 또는 용액	구성	처방
3 x 젤 버퍼	1.5M 아미노카프로산	아미노카프로산 3.94 g
	150mM 비스트리스	비스트리스 0.63 g
	dH2영형	dH2O를 20 mL에 첨가

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mm 셀 플레이트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	130182
40% 아크릴아미드/Bis 37.5:1	바이오 라드	Tel.: 161-0148
아미노카프로산	시그마	A2504 (영어
과황산암모늄	시그마	A3678
비스트리스	시그마	B7535
Bradford 단백질 분석 키트	바이오라드	5000006
셀 스크레이퍼	어부	11597692
쿠마시 블루 G250(세르바 블루 G)	세르바	35050
디지토닌	시그마	D141
DMEM을 참조하십시오.	론자	12-614층/12
에디타	생명 기술	제15575-038
FBS(증권 시세	생명 기술	10270106
소 태아 세럼	생명 기술	10270106
글리세롤	시그마	G5516
그라디언트 메이커	바이오 라드	1654120
라우릴 맥아시드(n-Dodecyl β-D-maltoside)	시그마	D4641
L-글루타민	생명 기술	25030024
L-글루타민	지브코	25030
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	시그마	T9281
PBS (PBS)	생명 기술	BE17-516F
페니실린/스트렙토마이신	론자	17-602E
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140
전원 공급 장치	GE 헬스케어	주당순이익 301
프로테아제 억제제	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	10137963
트랜스 블롯 터보 미니 PVDF	바이오라드	1704156
트리신	시그마	T9784
트립신-EDTA	지브코	15400054
수직 전기 영동 장치	바이오라드	1658004

) ) 호 호 표시기 년 년 )