$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 비오틴화 항체를 이용한 어레이의 기능화
- 다음 해결 방법을 준비합니다.
- T50 버퍼, 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 50mM NaCl의 용액. 이 솔루션은 RT에서 1개월 동안 안정적입니다.
- T50 완충액에 0.1 mg/mL의 BSA를 보충하여 T50-BSA를 주입합니다. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
- 1x PBS에 10mg/mL의 수소화붕소나트륨(NaBH4). 사용하기 직전에 준비하십시오.
- T50 buffer.
내 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin(재료 표 참조)
주의: NaBH4 는 환원제이며 가연성입니다. 사용 후에는 항상 질소 가스로 용기를 퍼지하고 건조기에 보관하십시오.
- biotinylated 항체로 어레이를 기능화합니다.
- 냉동고에서 PEG-비오틴 기능화 어레이를 제거하고 개봉하기 전에 원뿔형 튜브를 RT로 평형을 이룹니다. 어레이가 위로 향하게 한 커버슬립을 밀봉 필름이 늘어선 100mm 조직 배양물(TC100) 접시에 놓습니다.
메모: 오버헤드 조명을 최소화합니다. 모든 용액은 소수성 어레이에 의해 정의된 사각형에서 "비드 업"되어야 합니다. 각 사각형(일반적으로 10-15μL)을 완전히 덮을 수 있도록 적절한 부피의 용액을 추가하고 액체가 정의된 공간을 넘치지 않도록 합니다. 액체를 빠르게 제거하려면 진공 플라스크에 부착된 사내 진공 라인을 사용하여 폐기물을 포집하십시오. 화학 흄 후드에서 튜브를 열어 두어 폐기하기 전에 NaBH4가 1시간 동안 가스를 제거하도록 합니다. NaBH4 처리는 배경 자가형광을 줄여 위양성 단일분자 검출을 줄이는 데 필요합니다.
- RT에서 4분 동안 1x PBS에 10mg/mL의 NaBH4를 어레이의 각 사각형으로 처리합니다. PBS로 3회 세척합니다.
- T50에서 0.2mg/mL의 NeutrAvidin으로 각 사각형을 5분 동안 배양합니다. T50-BSA로 세 번 세척하십시오.
메모: NeutrAvidin은 PEG-비오틴에 결합하여 비오틴화 항체에 대한 결합 부위를 제공합니다.
- T50-BSA에서 2 μg/mL의 비오틴화된 POI 특이적 항체로 각 사각형을 10분 동안 배양하고 T50-BSA로 3회 세척합니다.
메모: 본 프로토콜은 EGFR-GFP를 포획하기 위해 비오틴화된 항-EGFR IgG(재료 표 참조)를 사용합니다.
2. 전체 세포 용해물에서 POI의 SiMPull
참고: 나머지 SiMPull 준비를 위해 기능화된 SiMPull 어레이의 TC100 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이 단계는 총 단백질 용해물에서 POI를 풀다운하는 것입니다. 용해물은 해동 후 재사용해서는 안 됩니다.
- 다음 해결 방법을 준비합니다.
- 4x PBS.
에 0.1% 파라포름알데히드(PFA)/0.1% 글루타르알데히드(GA)를 준비합니다.
주의: PFA와 GA는 독성 화학 정착제 및 잠재적 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 화학 물질을 유해 폐기물로 폐기하십시오.
- 10mM Tris-HCl, pH 7.4를 준비합니다.
- 용해물을 해동하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 용해물 1μL를 얼음처럼 차가운 T50-BSA.
100μL로 희석합니다.
메모: 필요한 경우, 어레이에 다양한 희석액을 적용하여 총 단백질 용해물의 적절한 희석 계수를 결정합니다. 어레이 영역당 SiMPull 수용체의 최적 밀도는 0.04-0.08/μm2입니다.
- 어레이에서 용해물을 10분 동안 배양한 다음 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI로 4번 세척합니다.
- AF647-conjugated anti-phosphotyrosine antibody(재료 표 참조)를 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI에 희석하고 1 h.
동안 어레이에서 배양합니다.
메모: 본 프로토콜에서는 EGFR-GFP의 인산화 집단을 확인하기 위해 팬 항-pTyr (PY99)-AF647 IgG를 사용합니다. 직접 표지된 항체를 사용하면 2차 항체의 필요성이 제거되어 표지 옵션이 증가하고 결과의 일관성이 향상됩니다. 형광 표지된 항체는 상용 공급원에서 얻을 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우, 표준 생체접합 기술을 사용하여 항체를 맞춤 표지할 수 있으며, 상용 생체접합 키트를 사용할 수 있습니다. 형광 표지된 항체의 각 배치는 용량 곡선을 측정하고 포화점을 찾기 위해 SiMPull을 수행하여 최적의 표지 조건을 위해 테스트해야 합니다.
- 얼음처럼 차가운 T50-BSA로 총 6-8분 동안 6번 세척합니다.
- 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
- 항체 해리를 방지하기 위해 4% PFA/0.1% GA 용액으로 어레이를 10분 동안 배양합니다.
- 5mM Tris-HCl, pH 10/PBS로 각각 7.4분 동안 두 번 세척하여 고정제를 비활성화합니다.
메모: 하나 이상의 항체를 사용하는 실험(예: 여러 포스포티로신 부위 검출)의 경우 2.5-2.9단계를 반복합니다.
3. 이미지 획득
참고: 단일분자 이미지 획득은 150x TIRF 대물렌즈와 emCCD 카메라의 특정 사분면에서 각 스펙트럼 채널을 캡처하는 이미지 스플리터를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조). 보정 이미지는 먼저 3 ± 1 μm(총 크기 ~60 μm × 60 μm)의 구멍 내 거리에서 200 ± 50 nm 구멍의 20 x 20 어레이를 포함하는 나노 패턴 채널 정렬 그리드(나노 그리드)를 사용하여 채널 등록 및 카메라 게인 보정을 허용하기 위해 획득됩니다.
- 아래 단계에 따라 채널 등록을 수행합니다.
메모: 이미터의 공동 국소화(colocalization)를 적절하게 계산하기 위해서는 정확한 채널 등록이 필요합니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 오일 대물렌즈를 청소하고 대물렌즈에 기름 한 방울을 떨어뜨립니다. 이미징을 위해 나노그리드를 스테이지에 놓습니다. 투과된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 초점을 맞춥니다.
메모: 나노그리드가 있는 이미지는 나노그리드를 통과하고 모든 스펙트럼 채널에서 감지되는 투과광을 사용하여 획득됩니다. 또는 각 채널에서 검출된 형광을 방출하는 다중 형광 비드를 사용할 수 있습니다. 이미지 획득은 각 현미경 설정에 따라 최적화되어야 합니다.
- 그리드의 이미지 20개를 획득합니다. 픽셀이 포화 상태가 아닌지 확인합니다. 이미지 시리즈를 "Fiducial"로 저장합니다.
- 나노 그리드의 초점을 흐리게 하여 Airy 패턴을 만듭니다. 게인 캘리브레이션을 위해 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "게인"으로 저장합니다.
- 모든 빛이 카메라로 들어오는 것을 차단하여 카메라 오프셋에 대한 일련의 20개 이미지를 획득합니다. 이미지를 "배경"으로 저장합니다.
- SiMPull 이미지 획득.
메모: 커버슬립 어레이를 이미징하기 전에 Tris 용액을 T50-BSA로 교환하고 어레이를 RT로 평형을 이룹니다.
- 오일 대물렌즈를 청소하고 대물렌즈에 추가 오일을 투입합니다. 현미경 스테이지에 커버슬립 어레이를 고정합니다.
- 각 형광단의 여기 전력, TIRF 각도 및 카메라 통합 시간을 최적화합니다. 목표는 샘플의 광표백을 최소화하면서 가장 높은 신호 대 잡음비를 달성하는 것입니다. 향후 측정에서 일관성을 유지하기 위해 레이저 출력을 기록합니다.
메모: 본 연구에서는 원적외선 채널에 대해 300ms의 노출 시간을, 녹색 채널에 대해 1초의 노출 시간을 사용했습니다. 642nm 레이저는 약 500μW의 레이저 출력에서 사용되었으며, 488nm 레이저는 튜브 렌즈 이전에 측정된 860μW에서 사용되었습니다.
- 각 샘플에 대한 이미지를 획득합니다. 먼저 원적외선 채널을 이미지화한 다음 광표백을 줄이기 위해 각각의 낮은 파장의 형광단을 이미지화합니다. 각 샘플에 사용되는 부피가 적기 때문에 30-45분마다 버퍼 레벨을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오.