단백질 인산화 분석을 위한 Single-molecule pull-down assay: 세포 용해물에서 단백질 인산화를 정량화하기 위한 고처리량 기법

초록

출처: Bailey, E. M. et al., 단백질 인산화 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석. J. Vis. 특급 (2022)

이 동영상은 단일 분자 풀다운 분석을 사용한 단백질 인산화의 민감한 정량화 기술을 보여줍니다. 폴리에틸렌 글리콜-비오틴의 기능화와 표지된 항체의 사용은 특이성을 가진 인산화 티로신의 검출을 증가시킵니다.

프로토콜

1. 비오틴화 항체를 이용한 어레이의 기능화

1. 다음 해결 방법을 준비합니다.
   1. T50 버퍼, 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 50mM NaCl의 용액. 이 솔루션은 RT에서 1개월 동안 안정적입니다.
   2. T50 완충액에 0.1 mg/mL의 BSA를 보충하여 T50-BSA를 주입합니다. 준비된 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
   3. 1x PBS에 10mg/mL의 수소화붕소나트륨(NaBH₄). 사용하기 직전에 준비하십시오.
   4. T50 buffer.
      내 0.2 mg/mL의 NeutrAvidin(재료 표 참조) 주의: NaBH₄ 는 환원제이며 가연성입니다. 사용 후에는 항상 질소 가스로 용기를 퍼지하고 건조기에 보관하십시오.
2. biotinylated 항체로 어레이를 기능화합니다.
   1. 냉동고에서 PEG-비오틴 기능화 어레이를 제거하고 개봉하기 전에 원뿔형 튜브를 RT로 평형을 이룹니다. 어레이가 위로 향하게 한 커버슬립을 밀봉 필름이 늘어선 100mm 조직 배양물(TC100) 접시에 놓습니다.
      메모: 오버헤드 조명을 최소화합니다. 모든 용액은 소수성 어레이에 의해 정의된 사각형에서 "비드 업"되어야 합니다. 각 사각형(일반적으로 10-15μL)을 완전히 덮을 수 있도록 적절한 부피의 용액을 추가하고 액체가 정의된 공간을 넘치지 않도록 합니다. 액체를 빠르게 제거하려면 진공 플라스크에 부착된 사내 진공 라인을 사용하여 폐기물을 포집하십시오. 화학 흄 후드에서 튜브를 열어 두어 폐기하기 전에 NaBH₄가 1시간 동안 가스를 제거하도록 합니다. NaBH₄ 처리는 배경 자가형광을 줄여 위양성 단일분자 검출을 줄이는 데 필요합니다.
   2. RT에서 4분 동안 1x PBS에 10mg/mL의 NaBH₄를 어레이의 각 사각형으로 처리합니다. PBS로 3회 세척합니다.
   3. T50에서 0.2mg/mL의 NeutrAvidin으로 각 사각형을 5분 동안 배양합니다. T50-BSA로 세 번 세척하십시오.
      메모: NeutrAvidin은 PEG-비오틴에 결합하여 비오틴화 항체에 대한 결합 부위를 제공합니다.
   4. T50-BSA에서 2 μg/mL의 비오틴화된 POI 특이적 항체로 각 사각형을 10분 동안 배양하고 T50-BSA로 3회 세척합니다.
      메모: 본 프로토콜은 EGFR-GFP를 포획하기 위해 비오틴화된 항-EGFR IgG(재료 표 참조)를 사용합니다.

2. 전체 세포 용해물에서 POI의 SiMPull

참고: 나머지 SiMPull 준비를 위해 기능화된 SiMPull 어레이의 TC100 접시를 얼음 위에 놓습니다. 이 단계는 총 단백질 용해물에서 POI를 풀다운하는 것입니다. 용해물은 해동 후 재사용해서는 안 됩니다.

1. 다음 해결 방법을 준비합니다.
   1. 4x PBS.
      에 0.1% 파라포름알데히드(PFA)/0.1% 글루타르알데히드(GA)를 준비합니다. 주의: PFA와 GA는 독성 화학 정착제 및 잠재적 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. 현지 규정 및 지침에 따라 화학 물질을 유해 폐기물로 폐기하십시오.
   2. 10mM Tris-HCl, pH 7.4를 준비합니다.
2. 용해물을 해동하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
3. 용해물 1μL를 얼음처럼 차가운 T50-BSA.
   100μL로 희석합니다. 메모: 필요한 경우, 어레이에 다양한 희석액을 적용하여 총 단백질 용해물의 적절한 희석 계수를 결정합니다. 어레이 영역당 SiMPull 수용체의 최적 밀도는 0.04-0.08/^μm2입니다.
4. 어레이에서 용해물을 10분 동안 배양한 다음 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI로 4번 세척합니다.
5. AF647-conjugated anti-phosphotyrosine antibody(재료 표 참조)를 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI에 희석하고 1 h.
   동안 어레이에서 배양합니다. 메모: 본 프로토콜에서는 EGFR-GFP의 인산화 집단을 확인하기 위해 팬 항-pTyr (PY99)-AF647 IgG를 사용합니다. 직접 표지된 항체를 사용하면 2차 항체의 필요성이 제거되어 표지 옵션이 증가하고 결과의 일관성이 향상됩니다. 형광 표지된 항체는 상용 공급원에서 얻을 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우, 표준 생체접합 기술을 사용하여 항체를 맞춤 표지할 수 있으며, 상용 생체접합 키트를 사용할 수 있습니다. 형광 표지된 항체의 각 배치는 용량 곡선을 측정하고 포화점을 찾기 위해 SiMPull을 수행하여 최적의 표지 조건을 위해 테스트해야 합니다.
6. 얼음처럼 차가운 T50-BSA로 총 6-8분 동안 6번 세척합니다.
7. 얼음처럼 차가운 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
8. 항체 해리를 방지하기 위해 4% PFA/0.1% GA 용액으로 어레이를 10분 동안 배양합니다.
9. 5mM Tris-HCl, pH 10/PBS로 각각 7.4분 동안 두 번 세척하여 고정제를 비활성화합니다.
   메모: 하나 이상의 항체를 사용하는 실험(예: 여러 포스포티로신 부위 검출)의 경우 2.5-2.9단계를 반복합니다.

3. 이미지 획득

참고: 단일분자 이미지 획득은 150x TIRF 대물렌즈와 emCCD 카메라의 특정 사분면에서 각 스펙트럼 채널을 캡처하는 이미지 스플리터를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조). 보정 이미지는 먼저 3 ± 1 μm(총 크기 ~60 μm × 60 μm)의 구멍 내 거리에서 200 ± 50 nm 구멍의 20 x 20 어레이를 포함하는 나노 패턴 채널 정렬 그리드(나노 그리드)를 사용하여 채널 등록 및 카메라 게인 보정을 허용하기 위해 획득됩니다.

1. 아래 단계에 따라 채널 등록을 수행합니다.
   메모: 이미터의 공동 국소화(colocalization)를 적절하게 계산하기 위해서는 정확한 채널 등록이 필요합니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
   1. 오일 대물렌즈를 청소하고 대물렌즈에 기름 한 방울을 떨어뜨립니다. 이미징을 위해 나노그리드를 스테이지에 놓습니다. 투과된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 초점을 맞춥니다.
      메모: 나노그리드가 있는 이미지는 나노그리드를 통과하고 모든 스펙트럼 채널에서 감지되는 투과광을 사용하여 획득됩니다. 또는 각 채널에서 검출된 형광을 방출하는 다중 형광 비드를 사용할 수 있습니다. 이미지 획득은 각 현미경 설정에 따라 최적화되어야 합니다.
   2. 그리드의 이미지 20개를 획득합니다. 픽셀이 포화 상태가 아닌지 확인합니다. 이미지 시리즈를 "Fiducial"로 저장합니다.
   3. 나노 그리드의 초점을 흐리게 하여 Airy 패턴을 만듭니다. 게인 캘리브레이션을 위해 20개의 이미지를 획득합니다. 이미지를 "게인"으로 저장합니다.
   4. 모든 빛이 카메라로 들어오는 것을 차단하여 카메라 오프셋에 대한 일련의 20개 이미지를 획득합니다. 이미지를 "배경"으로 저장합니다.
2. SiMPull 이미지 획득.
   메모: 커버슬립 어레이를 이미징하기 전에 Tris 용액을 T50-BSA로 교환하고 어레이를 RT로 평형을 이룹니다.
   1. 오일 대물렌즈를 청소하고 대물렌즈에 추가 오일을 투입합니다. 현미경 스테이지에 커버슬립 어레이를 고정합니다.
   2. 각 형광단의 여기 전력, TIRF 각도 및 카메라 통합 시간을 최적화합니다. 목표는 샘플의 광표백을 최소화하면서 가장 높은 신호 대 잡음비를 달성하는 것입니다. 향후 측정에서 일관성을 유지하기 위해 레이저 출력을 기록합니다.
      메모: 본 연구에서는 원적외선 채널에 대해 300ms의 노출 시간을, 녹색 채널에 대해 1초의 노출 시간을 사용했습니다. 642nm 레이저는 약 500μW의 레이저 출력에서 사용되었으며, 488nm 레이저는 튜브 렌즈 이전에 측정된 860μW에서 사용되었습니다.
   3. 각 샘플에 대한 이미지를 획득합니다. 먼저 원적외선 채널을 이미지화한 다음 광표백을 줄이기 위해 각각의 낮은 파장의 형광단을 이미지화합니다. 각 샘플에 사용되는 부피가 적기 때문에 30-45분마다 버퍼 레벨을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	MTC 약력	C2000
10mM 트리스-HCl pH 7.4
10mM 트리스-HCl pH 8.0/ 50mM NaCl			T50 버퍼
100mm 조직 배양 접시	셀트리트	229620	피라냐 에칭 유리/어레이 보관
15mL 코니컬 튜브
16% 파라포름알데히드 수용액	전자 현미경 과학	15710	위험한
50mL 코니컬 튜브			기능성 유리 보관 / KOH 재사용
8% 글루타르알데히드 수용액	전자 현미경 과학	16020	위험한
Alexa Fluor 647 NHS 에스테르	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A-20006
Anti-Human EGFR (외부 도메인) – 비오틴	Leinco 기술, Inc	101회
p-Tyr 항체 (PY99) Alexa Fluor 647	산타 크루즈 생명 공학	사우스 캐롤라이나-7020 AF647
비오틴-PEG	레이산 바이오	비오틴-PEG-SVA, MW 5,000
소 혈청 알부민	골드 바이오테크놀러지	A-420-1	Tyrode's Buffer 컴포넌트
커버 슬립 24 x 60 # 1.5	전자 현미경 과학	63793
emCCD 카메라	안도르 익손
포스포타아제 및 프로테아제 억제제 중단 칵테일 (100X)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	78446	Lysis Buffer 구성 요소
얼음
이머졸 518F 이멀젼 오일	자이스	444960-0000-000
사내 진공 라인
Mix-n-Stain CF 염료 항체 라벨링 키트	비오티움	92245
나노그리드	미랄로마테크
NeutrAvidin 비오틴 결합 단백질	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31000
질소(압축 가스)
Olympus iX71 현미경	올림푸스
Parafilm M 씰링 필름	연구소 창고	HS234526C
PBS 산도 7.4	케이슨 랩스	PBL06
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) 마우스 mAb	세포 신호 전달 기술	2236BF
쿼드 뷰 이미지 스플리터	포토메트릭스	모델 QV2
Semrock 방출 필터: 청색(445/45nm), 녹색(525/45nm), 적색(600/37nm), 원적외선(685/40nm)	셈록	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
수소화붕소나트륨(NaBH4)	밀리포어 시그마	452874	위험한

시리즈 년 년 ) ) 년 ) 년