Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

초록

출처: Curtis, B. N. et al. 생물물리학적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 셉틴 어셈블리를 재구성합니다. J. Vis. 특급 (2022년)

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 평면 지질 이중층

1. 슬라이드의 플라즈마 청소
   메모: 플라즈마 클리닝은 유기 오염 물질을 제거하고 유리의 친수성을 높여 효율적인 지질 흡착을 보장합니다. 다음 단계는 사용하는 플라즈마 세정제 및 유리 커버슬립에 따라 변경되거나 최적화되어야 할 수 있습니다.
   1. 플라즈마 세정기를 산소로 5분 동안 퍼지하여 라인과 챔버에서 공기를 제거합니다. 이는 플라즈마 클리너가 실행될 때 라인과 챔버에 주로 산소가 있어 보다 일관된 이중층 준비를 제공하도록 하기 위한 것입니다.
   2. 퍼지하는 동안_N2 또는 Ar과 같은 불활성 가스를 마이크로 커버 유리 슬라이드 위로 흘려보내 먼지와 미립자를 제거합니다.
      선택적: 커버 유리 슬라이드는 각 면에 100% 이소프로판올을 분사한 다음 물을 뿌려 세척할 수 있습니다. 이소프로판올-물 세척을 3회 반복한 다음 N₂ 스트림으로 건조시킵니다.
   3. 드라이 커버 유리 슬라이드를 세라믹 크래들에 배열합니다. 크래들을 플라즈마 챔버 뒤쪽에 배치하여 커버슬립이 챔버의 긴 가장자리와 평행이 되도록 합니다(이렇게 하면 플라즈마 세척 중에 제자리에 유지됨). 최대 전력으로 산소로 플라즈마 클리너를 15분 동안 실행합니다.
2. 챔버 준비
   메모: 여기에 설명된 방법은 반응 부피를 지원하기 위해 플라스틱 PCR 튜브의 수제 챔버를 사용하지만, 실리콘 웰과 같은 다른 저접착 물질도 적합할 수 있습니다.
   1. 면도날이나 가위를 사용하여 0.2mL PCR 튜브의 젖빛 부분 바로 아래에 있는 캡을 잘라냅니다(그림 1).
   2. 튜브 내부를 피하면서 PCR 튜브의 가장자리를 UV 활성 접착제로 칠합니다. PCR 튜브 접착제를 플라즈마 세척 커버슬립의 중앙에 부드럽게 놓습니다.
      메모: 챔버 내부에 접착제가 묻지 않도록 최소한의 접착제를 사용하여 밀봉하고 챔버를 부딪히거나 방해하지 않고 즉시 UV로 처리하십시오.
   3. 챔버를 장파장 UV 광선 아래에 5-7분 동안 놓아 접착제를 경화시킵니다.
3. 이중층 형성
   메모: 효율적인 이중층 형성을 위해 이 단계에서 단분산 SUV를 사용해야 합니다. 표 1은 스톡 및 최종 완충액 농도를 포함하여 이중층 형성에 사용되는 모든 완충액에 대한 레시피를 제공합니다.
   1. 40 μL의 지원되는 지질 이중층 완충액(SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl₂; 표 1), 10 μL의 5 mM SUV 및 1 μL의 100 mM CaCl₂를 웰에 투입한다. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 방해한 다음 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
      메모: 증발을 제한하려면 물티슈로 덮인 페트리 접시에서 배양하십시오.
4. 과도한 지질 씻어내기
   메모: 이 단계는 과도한 SUV를 제거하고 버퍼 교환 단계로 작동합니다. 세탁하는 동안 피펫 팁으로 이중층을 긁지 않는 것이 매우 중요합니다. 유리가 노출되면 셉틴과 다른 많은 단백질이 비가역적으로 결합하여 효과적인 단백질 농도를 감소시킵니다.
   1. 배양 후 150μL의 SLBB로 이중층을 6x 헹구고 기포를 피펫팅하여 매번 혼합합니다.
      참고: 150 μL를 50 μL의 완충액에 직접 첨가하고 반응 웰에 총 200 μL를 위해 이미 존재하는 SUV를 추가합니다.
   2. 셉틴 또는 선택한 다른 단백질로 배양을 시작할 준비가 되면 150μL의 반응 완충액(RXN: 33.3mM KCl, 50mM HEPES, pH 7.4, 1.4mg/mL BSA, 0.14% 메틸셀룰로오스, 1mM BME)으로 이중층을 6x 세척합니다
      알림: 최상의 결과를 얻으려면 반응 버퍼를 신선하게 만들고 반응을 잘 혼합하는 동안 기포를 피하기 위해 매우 주의하십시오.
   3. 마지막 세척 단계에서 125μL의 반응 완충액을 제거하고 웰에 75μL를 남깁니다. 셉틴 저장 완충액(SSB: 300mM KCl, 50mM HEPES, pH 7.4, 1mM BME)에 희석된 셉틴 25μL를 원하는 농도로 추가하고 TIRF 현미경으로 이미지를 만듭니다.
      메모: 이 분석을 처음 설정하거나 새로운 지질 조성을 통합할 때 광표백 후 형광 회수(FRAP)를 사용하여 지질이 표면에서 자유롭게 확산되도록 하는 것이 좋습니다. 회복 속도는 지질 조성에 따라 다르고 본질적으로 독립형 시스템보다 낮지만 지질은 움직이지 않아야 합니다.

표 1: 지원되는 지질 이중층 및 반응 준비를 위한 완충액 성분. 완충액에 통합된 원액의 부피와 각 성분의 최종 농도가 표시됩니다. SLB 및 PRB는 실온에서 보관하고 실험 사이에 재사용할 수 있습니다. 반응 버퍼와 SSB는 각 실험에 대해 새로 만들어집니다.

표시기 표시기

지원 지질 이중층 버퍼(SLBB)
주식	음량	최종 집중
2M KCl	1.5 밀리리터	300 밀리미터미터
1 M 헤페스	200 마이크로L	20 밀리미터미터
500 mM 마그네슘2	20 마이크로L	1 밀리엠
물	8 밀리리터
사전 반응 버퍼(PRB)
주식	음량	최종 집중
2M KCl	166 μL	33.3 밀리미터
1 M 헤페스	500 마이크로L	50 밀리미터.
물	9.33 밀리리터
반응 버퍼
주식	음량	최종 집중
2M KCl	166 μL	33.3 밀리미터
1 M 헤페스	300 마이크로L	50 밀리미터.
10 mg/mL BSA	1.39 밀리리터	1.39 mg/mL
1% 메틸셀룰로오스	1.39 밀리리터	0.0014
물	최대 10mL
증권 시세	0.7 μL	1 밀리엠
셉틴 저장 버퍼(SSB)
주식	음량	최종 집중
2M KCl	1.5 밀리리터	300 밀리미터미터
1 M 헤페스	500 마이크로L	50 밀리미터.
물	최대 10mL
증권 시세	0.7 μL	1 밀리엠

결과

그림 1: 설정된 반응 챔버의 개략도. 맞춤형 챔버를 준비하기 위해 튜브가 가늘어지기 시작하는 위치와 캡(빨간색 점선)에서 0.2mL PCR 튜브를 절단합니다. 그런 다음 절단 튜브의 절단되지 않은 가장자리를 UV 활성 접착제(파란색)의 얇은 층으로 코팅하고 커버슬립에 접착제를 놓습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 mL PCR 튜브(플랫 캡 포함), 내추럴	왓슨	137-211C(예)
헤페스	시그마 알드리치	H3375-1KG
염화마그네슘	폭스바겐	7791-18-6
메틸 셀룰로오스 4000cp	시그마-알드리치	M052-100지
평면 이중층을 위한 마이크로글라스 커버슬립	마츠나미	중단	22x22 연중
광학 접착제	놀랜드 톨랩스	NOA 68	유리 또는 플라스틱을 위한 유연한 접착제
플라즈마 클리너	플라즈마 에칭	체육-25	전압 : 120V, 60Hz. 전류 : 15 암페어
염화칼륨	폭스바겐	0395-1킬로그램
UV 램프	스펙트롤린	ENF-260C	115볼트, 60Hz, 0.20암페어
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4612-25G
베타 메르캅토에탄올(BME)	시그마-알드리치	M6250-100ML
증권 시세	Avanti 극성 지질	850375
에그 리스 로다민 PE	Avanti 극성 지질	810146

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